Test d’extraction Msp1 pour étudier l’élimination des protéines TA mal localisées

Msp1, une ATPase dans la membrane externe mitochondriale, élimine les protéines mal localisées ancrées à la queue, ou TA, de la membrane via son pore central hexamérique, facilitant ainsi leur dégradation.

Pour comprendre le mécanisme de la translocation, co-reconstituer les protéines TA et Msp1 en liposomes, permettant leur intégration dans la bicouche lipidique.

Préparez un mélange réactionnel en ajoutant les liposomes reconstitués à un tampon approprié contenant des chaperons - protéines de contrôle de la qualité cytosolique. Les chaperons sont marqués avec l’enzyme glutathion-S-transférase ou GST.

Ajoutez de l’adénosine triphosphate (ATP) à la réaction. La Msp1 se lie aux molécules d’ATP et les hydrolyse. En utilisant l’énergie générée par l’hydrolyse, Msp1 transloque les protéines TA liées à la membrane à travers son pore central. Les chaperons du mélange réactionnel se lient au domaine transmembranaire des protéines TA extraites.

Ensuite, chargez le mélange réactionnel sur une colonne de purification d’affinité. La colonne contient une résine conjuguée à du glutathion réduit ou GSH. La protéine GST sur les chaperons se lie au GSH conjugué – son substrat – en attachant les com