Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 5:00 min • July 8th, 2025
Les neurotransmetteurs monoamines, messagers chimiques endogènes, relaient les signaux à travers la synapse, le point de contact entre les neurones. Un système de neurotransmetteurs monoamines étroitement régulé est essentiel à la fonction neuronale normale.
Pour dépister l’effet d’un médicament testé sur la libération de monoamine ex vivo, obtenir des coupes de tissu cérébral de rat contenant la région d’intérêt dans un tampon oxygéné réfrigéré, en maintenant la viabilité des tissus.
Transférez les coupes de tissu dans les puits d’une plaque multi-puits, avec des inserts filtrants poreux reliés à une alimentation en mélange gazeux et comprenant du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné, aCSF, complété par des inhibiteurs de la monoamine oxydase. Couver.
Les inhibiteurs diffusent dans les cellules et inactivent les enzymes monoamine oxydase, empêchant la dégradation des monoamines et augmentant leur concentration disponible pour le stockage et la libération.
Transférez les inserts contenant du tissu dans des puits contenant du LCRa oxygéné et le médicament à l’essai. Couver. Le médicament peut stimuler le système de neurotransmetteurs de la monoamine, augmentant la concentration de monoamine dans l’espace extraneuronal, conduisant à leur libération du tissu cérébral en solution.
Les monoamines libérées passent à travers les inserts poreux dans les puits, se séparant du tissu.
Après l’incubation, retirez les inserts contenant la tranche de tissu. Recueillir la solution de monoamine dans un tube composé d’un solvant compatible avec la chromatographie liquide à haute performance, HPLC. Transférez le contenu du tube dans des unités de filtration pré-assemblées. Centrifugeuse, éliminant les principaux contaminants.
Chargez le filtrat obtenu dans la colonne HPLC et effectuez une chromatographie pour déterminer la concentration de monoamine, indicative de l’effet du médicament testé sur la libération de monoamine.
Pour induire la libération de monoamines, transférez les échantillons de tissus dans chaque puits d’une chambre d’efflux de 48 puits faite sur mesure, contenant 0,5 à 1 millilitre de tampon d’efflux par puits avec un bouillonnement constant et doux, et laissez les échantillons récupérer pendant 30 à 50 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de la période d’équilibre, déplacez le support de tissu avec du tissu cérébral, vers des puits contenant 500 microlitres de tampon d’efflux oxygéné avec ou sans agent pharmacologique, en tapotant le support sur le bord du puits pour empêcher le transfert minimal de tampon entre les puits, pour une incubation de 20 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, déplacez le support vers un nouvel ensemble de puits contenant 500 microlitres de tampon d’efflux avec ou sans le médicament d’intérêt, et retournez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, pendant 20 minutes supplémentaires.
Au cours de la deuxième incubation, transférez la solution des puits de la première incubation dans des tubes de microcentrifugation contenant 50 microlitres d’acide perchlorique ou phosphorique 1 N sur glace, et étiquetez les tubes #1.
À la fin de la deuxième incubation, déplacez le support de tissu dans les puits vides avec la plaque sur de la glace, et transférez les surnageants de la deuxième incubation dans de nouveaux tubes de microcentrifugation contenant 50 microlitres d’acide perchlorique ou phosphorique 1 N, sur de la glace. Étiquetez ces tubes #2.
Lorsque tous les surnageants ont été transférés, ajoutez 1 millilitre de tampon de dissection glacé à chaque puits de tissu et utilisez de petites pinces à épiler pour transférer chaque échantillon de tissu dans un nouveau tube de microcentrifugation. Retirez le tampon des tubes d’échantillon et conservez les mouchoirs à -80 degrés Celsius. Ensuite, transférez les solutions d’incubation collectées dans des tubes filtrants de microcentrifugation pour la centrifugation, et placez le filtrat sur de la glace, jusqu’à l’analyse HPLC.