JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 2:52 min • July 8th, 2025
Les feuillets valvulaires aortiques contiennent une population hétérogène de cellules interstitielles valvulaires, ou VIC, réparties dans les couches de la matrice extracellulaire. Lors de la stimulation, les CIV se transforment en ostéoblastes, des cellules formant la matrice osseuse.
Les ostéoblastes matures sécrètent du collagène et des protéines de la matrice osseuse. Ces protéines aident les ostéoblastes à se fixer à la matrice. Enfin, les ions calcium intracellulaires pénètrent dans le milieu matriciel et, avec les phosphates, se déposent sous forme de nodules minéralisés, entraînant une calcification de la valve aortique.
Pour évaluer la concentration de calcium dans les valves aortiques calcifiées, il faut commencer par une culture de CIV dans une plaque à six puits. Jetez le milieu de culture, ajoutez un milieu ostéogénique dans le puits et incuberez.
Pendant l’incubation, l’insuline dans le milieu ostéogénique stimule les CIV à se différencier en phénotypes ostéogéniques. Ces ostéoblastes sécrètent des protéines de la matrice osseuse et de l’acide ascorbique dans le milieu ostéogénique, ce qui les induit à former une matrice extracellulaire riche en collagène.
Enfin, le calcium intracellulaire des ostéoblastes et les phosphates du milieu forment des cristaux minéralisés dans le milieu.
Retirez le milieu et ajoutez la solution d’acide chlorhydrique. Incuber pour solubiliser les ions calcium dans la solution. Versez le milieu acide contenant du calcium dans le puits d’une plaque à plusieurs puits.
Ajoutez un colorant sensible au calcium et incuber. Les molécules de colorant se lient aux ions calcium dans le milieu acide, formant un complexe colorant-calcium de couleur violette.
Mesurez l’absorbance du complexe, qui est proportionnelle à la concentration de calcium dans l’échantillon.
Avant de commencer l’essai, nettoyez le capot de biosécurité avec de l’éthanol à 70 % et réchauffez le milieu DMEM à 37 degrés Celsius. Ensuite, ensemencez 100 000 cellules par condition dans des plaques à 6 puits dans du DMEM complet, et cultivez à 37 degrés Celsius.
Après 24 heures, remplacez le milieu surnageant par le milieu calcifiant et incubez les cellules pendant 7 jours à 37 degrés Celsius, en remplaçant le milieu le troisième jour.
Après 7 jours, mesurez la concentration de calcium dans une plaque de 96 puits à l’aide du réactif Arsenazo III et en enregistrant l’absorbance à 650 nanomètres.