Dosage des plaies pour évaluer la capacité migratoire des myoblastes murins en co-culture

En réponse à une blessure, les cellules sécrétoires produisent des molécules de signalisation paracrine pour activer les myoblastes, des cellules musculaires indifférenciées. Les myoblastes activés migrent vers le site de la plaie, où ils prolifèrent, provoquant la cicatrisation de la plaie.

Pour évaluer la capacité migratoire des myoblastes in vitro, on prend une plaque multipuits contenant une monocouche confluente de myoblastes murins. À l’aide d’une pointe de pipette, grattez la monocouche pour créer une tache linéaire et sans cellule à l’intérieur du puits, qui simule le site de la plaie.

Complétez soigneusement le puits avec le milieu de croissance sans perturber le patch de la plaie.

Prenez un insert membraneux contenant une culture adhérente de cellules de la crête neurale, ou NCC (cellules sécrétoires), dans un milieu approprié. Placez l’insert à l’intérieur du puits, de sorte que les NCC à la base soient près du patch de la plaie. Incuber la co-culture pendant la durée souhaitée.

Au cours de l’incubation, les NCC libèrent des molécules de signalisation qui se lient aux récepteurs spécifiques des myoblastes, initiant une cascade de signalisation. Cette signalisation facilite la réorganisation de l’actine dans les myoblastes, et par conséquent, ces cellules développent des projections cytoplasmiques telles que des lamelleslipodes et des filopodes, sur leurs bords. Ces projections aident les myoblastes à migrer vers la zone blessée et à se repeupler progressivement, conduisant à la cicatrisation des plaies.

Placez la plaque sous un microscope et observez la cicatrisation de la plaie, dont l’ampleur est en corrélation avec la capacité migratoire des myoblastes en co-culture.

Lorsque les cellules atteignent une confluence de 70 % à 80 %, retirez le milieu surnageant du puits de la chambre C2C12 et lavez les cellules une fois avec du PBS.

Après avoir retiré le PBS, commencez à gratter les cellules en passant fermement la pointe d’une pipette P10 stérile, dans une seule direction pour couvrir toute la longueur ou la largeur de la monocouche cellulaire. Une fois les cellules grattées, ajoutez rapidement 1 millilitre de PBS.

Ensuite, allumez l’ordinateur et le microscope. Placez la glissière de chambre sur la platine et tournez le cadran de l’objectif à un grossissement de 5X. Ouvrez le logiciel d’imagerie, cliquez sur l’onglet « Caméra », puis cliquez sur le bouton « Live » pour visualiser les cellules sur l’onglet « AxioCam IC ».

Assurez-vous que le filtre de lumière est tiré à fond pour permettre à la lumière de passer vers l’appareil photo et l’écran de l’ordinateur. Déplacez ou tournez manuellement la glissière de la chambre pour positionner la zone de la plaie au centre de l’image en direct sur l’onglet « AxioCam IC ». Pour prendre des images, cliquez sur « Snap » pour ouvrir un onglet « Nouveau » à côté de l’onglet « AxioCam IC » qui contient l’image.

Pour enregistrer cette image fixe, cliquez sur « Fichier », sélectionnez « Enregistrer sous », sélectionnez « Bureau » dans la barre de gauche pour enregistrer le fichier sur le bureau. Entrez le « Nom du fichier » dans la case du nom du fichier et enregistrez la figure au format de fichier « .czi ».

Pour enregistrer l’image en tant que « .tiff », cliquez sur « Fichier », sélectionnez « Enregistrer sous », entrez le « Nom du fichier » dans la zone du nom de fichier, cliquez sur le bouton « Enregistrer sous le type » et sélectionnez « *.tiff » dans le menu déroulant.

Repositionnez manuellement la lame de la chambre pour prendre deux à trois autres images à d’autres points de la plaie dans le même puits. Après l’imagerie, retirez le PBS de chaque puits et ajoutez 1 millilitre de milieu C2C12.

Assemblez le système de co-culture en plaçant manuellement les inserts contenant les cellules O9-1 dans chaque puits du puits de la chambre. Poussez doucement les inserts vers le bas dans le puits de sorte que le bas de l’insert se trouve juste au-dessus des cellules C2C12 sous-jacentes. Remettez les constructions bien insérées dans l’incubateur et laissez les cellules migrer pendant un total de 9 à 12 heures.

Pour déterminer le moment optimal de migration, vérifiez les cellules six heures après la création de la plaie, puis toutes les deux à trois heures par la suite. Terminez l’expérience lorsque les cellules dans les conditions de contrôle recouvrent complètement la plaie.