Dosage des comètes pour la détection des dommages à l’ADN dans les cellules

L’exposition à des agents nocifs induit des cassures simple et double brin de l’ADN cellulaire, ce qui entraîne des dommages à l’ADN.

Pour détecter les dommages à l’ADN, commencez par une suspension unicellulaire de cellules traitées chimiquement dans de l’agarose liquéfiée à bas point de fusion. Chargez la suspension sur une lame de verre et laissez l’agarose se solidifier, ce qui permet l’immobilisation des cellules dans la matrice de gel poreuse.

Traitez les cellules avec un tampon de lyse. Les détergents contenus dans le tampon solubilisent les membranes cellulaires et nucléaires, tandis que les sels éliminent les histones de l’ADN, formant un corps nucléoïde contenant de l’ADN attaché à la matrice nucléaire.

Incuber les lames dans un tampon d’électrophorèse alcalin. Cela provoque le déroulement de l’ADN et la génération de fragments simple brin. Placez la lame dans un appareil d’électrophorèse et connectez-la à l’alimentation électrique. Cela permet la migration de l’ADN chargé négativement vers l’anode positive.

L’ADN non endommagé reste restreint dans le corps nucléoïde. En revanche, les fragments d’ADN plus petits et endommagés commencent à se déplacer vers l’anode. Ce mouvement différentiel forme une structure semblable à celle d’une comète, dans laquelle l’ADN non endommagé forme la tête, tandis que l’ADN endommagé forme la queue de la comète.

Incuber la lame dans un tampon de neutralisation pour permettre aux fragments d’ADN simple brin de se renaturer. Ensuite, traitez la lame avec un colorant fluorescent qui colore l’ADN. Visualisez la lame sous un microscope à fluorescence.

L’intensité et la longueur de la queue sont en corrélation avec le degré de dommages à l’ADN cellulaire.

Pour commencer, préparez de l’agarose à 0,6 % à bas point de fusion dans du PBS et placez-la dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Étiquetez l’extrémité givrée des lames pré-couchées avec le nom, la date et les informations de traitement à l’aide d’un marqueur permanent ou d’un crayon.

Placez une plaque de refroidissement sur un banc plat et insérez deux blocs réfrigérants congelés dans le tiroir coulissant sous la surface métallique. Ensuite, placez les lames sur la plaque de refroidissement pour pré-refroidir pendant 1 à 2 minutes. Centrifugez et retirez le surnageant des tubes d’échantillon, puis remettez-les immédiatement sur de la glace. Remettre en suspension la pastille de cellule avec 200 microlitres d’agarose à 0,6 % à bas point de fusion et mélanger par pipetage.

Ensuite, ajoutez 80 microlitres de cellules contenant de l’agarose sur une lame réfrigérée et placez rapidement une lamelle sur le gel. Laissez le gel prendre sur la plaque de refroidissement pendant 1 à 2 minutes. Pendant ce temps, préparez 500 millilitres de solution de travail de tampon de lyse et versez-la dans le plat de lyse.

Une fois que les gels ont pris, retirez rapidement les lamelles en tenant doucement la glissière entre le pouce et l’index, et en faisant glisser la lamelle hors du gel. Ensuite, placez les diapositives à l’intérieur d’un porte-diapositives, avec tous les points noirs sur les diapositives orientés dans la même direction. Placez le support de diapositives à l’intérieur du bol de lyse. Fermez le couvercle du bol de lyse et mettez-le pour l’incubation.

Retirez délicatement le support de lames de la boîte de lyse sans déranger les gels. Placez délicatement le support de glissière dans un plat à laver préchargé d’eau glacée bidistillée. Assurez-vous que les lames sont complètement immergées et laissez la configuration pendant 30 minutes.

Placez un bloc réfrigérant congelé sous le réservoir d’électrophorèse pour maintenir une température tampon optimale. Ensuite, ajoutez une solution de travail d’électrophorèse glacée dans le réservoir et transférez-y le support de diapositives. Orientez les lames de manière à ce que la cellule contenant les gels pointe vers la cathode.

Incuber les lames dans le réservoir d’électrophorèse pendant 20 minutes, pour permettre à l’ADN de se dérouler. Ensuite, allumez l’alimentation électrique pour effectuer une électrophorèse pendant 20 minutes à 1,19 volts par centimètre. Une fois l’électrophorèse terminée, coupez l’alimentation électrique et retirez le support de diapositive du réservoir d’électrophorèse. Laissez le porte-lames s’égoutter sur du papier de soie pendant 30 secondes.

Ensuite, placez le support de diapositives dans un plat contenant un tampon de neutralisation et laissez-le pendant 20 minutes. Ensuite, placez-le dans un plat contenant de l’eau glacée double distillée et laissez-le pendant 20 minutes. Après le lavage, retirez le support de lames de l’eau et laissez les lames sécher dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 1 heure.

Pour réhydrater les lames, transférez le porte-lames dans un plat à laver contenant de l’eau glacée bi-distillée et laissez-le pendant 30 minutes. Ensuite, placez le support de diapositive dans un plat de coloration contenant une solution d’iodure de propidium de 2,5 microgrammes par millilitre.

Fermez le couvercle du plat de coloration et incubez-le pendant 20 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Après l’incubation, transférez le support de lames dans un plat séparé et lavez-le avec de l’eau glacée doublement distillée pendant 20 minutes.

Retirez le support de lames du plat et séchez-le complètement dans l’obscurité, soit dans un incubateur à 37 degrés Celsius, soit à température ambiante. Une fois les lames complètement sèches, rangez-les dans une boîte à diapositives dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’analyse d’image.