Dosage de l’absorption des acides aminés radiomarqués pour quantifier l’absorption cellulaire des acides aminés

Les transporteurs d’acides aminés sont des protéines liées à la membrane qui interviennent dans le transfert d’acides aminés à travers les membranes cellulaires, régulant les processus cellulaires vitaux.

Pour étudier l’absorption des acides aminés in vitro, prenez une culture de cellules stromales dérivées de la moelle osseuse de souris. Aspirez le milieu de croissance. Ajoutez un tampon préchauffé complété par de la glutamine – un acide aminé – marqué avec de l’hydrogène radioactif. Incuber pendant la durée requise.

Le tampon préchauffé fournit la température physiologique et un pH approprié requis pour l’absorption cellulaire de la glutamine. Les transporteurs de glutamine se composent de domaines de transport - responsables de la translocation du substrat via le co-transport couplé aux ions sodium - et de domaines d’échafaudage ancrés dans une membrane.

Le domaine de transport se lie à la glutamine radiomarquée avec les ions sodium du tampon. Lors de la liaison, il libère les molécules dans le cytoplasme. Simultanément, le domaine de transport déplace les ions sodium intracellulaires et les acides aminés neutres à l’extérieur de la cellule, ce qui entraîne l’homéostasie cellulaire.

Lavez les cellules avec un tampon glacé, mettant fin à la réaction et éliminant toute glutamine radiomarquée extracellulaire. Ajoutez une solution détergente. Le détergent lyse les cellules, provoquant la libération de glutamine radiomarquée intracellulaire.

Centrifuger le lysat. Ajoutez le surnageant contenant de la glutamine dans un flacon avec un cocktail à scintillation, et placez le flacon à l’intérieur d’un comptoir à scintillation.

Les molécules de glutamine radiomarquées émettent des particules bêta de haute énergie. Les scintillateurs du cocktail absorbent les particules et émettent des impulsions lumineuses qui sont détectées par le compteur de scintillation.

Mesurez la radioactivité pour estimer l’absorption cellulaire de glutamine.

Pour commencer le test d’absorption des acides aminés, plaquez 5 x 10⁴ cellules ST2, dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits dans un milieu alpha-MEM complété par FBS, pénicilline et streptomycine. Plaquez des puits supplémentaires de cellules pour quantifier le nombre de cellules par condition pour les normalisations.

Ensuite, incubez des cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours jusqu’à ce qu’elles confluent. Après l’incubation, aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS à pH 7,4. Ensuite, aspirez le PBS avant de laver une fois les cellules, avec un millilitre de Krebs Ringers HEPES, ou KRH.

Incuber des cellules avec 0,5 millilitre de KRH fraîchement préparé contenant quatre microcuries par millilitre de milieu de travail L-[3,4-3 H]-Glutamine pendant cinq minutes. Après l’incubation, recueillir le milieu radioactif pour le distribuer dans le conteneur de déchets liquides. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du KRH glacé pour terminer la réaction.

Ensuite, ajoutez un millilitre de dodécylsulfate de sodium à 1 % dans chaque puits et triturez le mélange 10 fois pour lyser et homogénéiser les cellules. Ensuite, transférez les lysats cellulaires dans un tube de 1,5 millilitre et clarifiez le lysat en le centrifugant à une vitesse minimale de 10 000 g pendant 10 minutes.

Transférez le surnageant dans un flacon à scintillation, contenant huit millilitres de solution de scintillation, et lisez la radioactivité en comptages par minute à l’aide d’un compteur à scintillation.

À partir des plaques non radioactives restantes, trypsiniser, remettre en suspension et compter les cellules pour estimer le nombre de cellules dans les cultures radioactives lysées. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre de cellules par puits non radioactif pour chaque condition expérimentale.