Dosage colorimétrique pour la quantification du lactate dans les échantillons d’essai

Dans les cellules vivantes, dans des conditions anaérobies, l’enzyme lactate déshydrogénase convertit le pyruvate – un produit final de la glycolyse – en lactate – un métabolite clé. La quantité de lactate produite dans les cellules reflète leur état métabolique.

Pour quantifier la concentration intracellulaire de lactate, commencez par un échantillon d’essai de lysat de cellules de nématodes sans protéines. Complétez les autres puits d’une plaque multipuits avec une solution de lactate de diverses concentrations connues.

Le lysat est dépourvu de toutes les enzymes protéiques, y compris la lactate déshydrogénase endogène, ce qui garantit une quantification précise du lactate.

Ajouter un tampon de dosage de lactate dans chaque puits pour maintenir le pH approprié pour une activité enzymatique optimale. Complétez les puits avec un mélange réactionnel contenant l’enzyme lactate déshydrogénase, le nicotinamide-adénine dinucléotide (NAD), une coenzyme et une sonde colorimétrique et incubez.

Au cours de l’incubation, la lactate déshydrogénase catalyse l’oxydation du lactate cellulaire en pyruvate, avec une réduction simultanée du NAD en NADH. Le NADH généré réagit avec la sonde colorimétrique pour produire un produit violet.

Mesurer spectroscopiquement l’absorbance de la solution violette pour l’échantillon d’essai et les étalons de lactate à 570 nanomètres. Tracez les valeurs d’absorbance des étalons de lactate et générez la courbe d’étalonnage.

Enfin, comparez la valeur d’absorbance de l’échantillon avec les étalons de lactate pour déterminer la quantité de lactate présente dans l’échantillon d’essai.

Pour mesurer la concentration de lactate, utilisez un kit de dosage colorimétrique pour effectuer une analyse en double des échantillons de test. Ajoutez 10 microlitres d’échantillons d’essai dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, puis ajoutez un tampon de dosage de lactate à chaque échantillon pour ajuster le volume à 50 microlitres.

Diluer 100 millimolaires de L(+)-Lactate standard avec un tampon de dosage de lactate à 1 millimolaire. Ensuite, dans une série de puits, ajoutez 0, 2, 4, 6, 8 et 10 microlitres de L(+)-Lactate dilué standard. Ajoutez 50 microlitres de mélange réactionnel dans chaque puits et incubez à température ambiante à l’abri de la lumière pendant au moins 30 minutes pour que la couleur se développe.

Enfin, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance de chaque puits à 570 nanomètres. Soustrayez l’absorbance du mélange témoin d’arrière-plan de l’absorbance du mélange réactionnel. Ensuite, tracez la courbe standard de lactate et calculez les concentrations de lactate à partir de la courbe en multipliant chaque concentration par 2,25.