Dosage colorimétrique pour la quantification du lactate dans les échantillons d’essai

Dans les cellules vivantes, dans des conditions anaérobies, l’enzyme lactate déshydrogénase convertit le pyruvate – un produit final de la glycolyse – en lactate – un métabolite clé. La quantité de lactate produite dans les cellules reflète leur état métabolique.

Pour quantifier la concentration intracellulaire de lactate, commencez par un échantillon d’essai de lysat de cellules de nématodes sans protéines. Complétez les autres puits d’une plaque multipuits avec une solution de lactate de diverses concentrations connues.

Le lysat est dépourvu de toutes les enzymes protéiques, y compris la lactate déshydrogénase endogène, ce qui garantit une quantification précise du lactate.

Ajouter un tampon de dosage de lactate dans chaque puits pour maintenir le pH approprié pour une activité enzymatique optimale. Complétez les puits avec un mélange réactionnel contenant l’enzyme lactate déshydrogénase, le nicotinamide-adénine dinucléotide (NAD), une coenzyme et une sonde colorimétrique et incubez.

Au cours de l’incubation, la lactate déshydrogénase catalyse l’oxydation du lactate cellulaire en pyruvate, avec une réduction simultanée du NAD en NADH. Le NADH généré réagit avec la sonde colorimét