Dosage spectrophotométrique pour déterminer l’activité de la glycogène synthase

La glycogène synthase – une enzyme cruciale dans la synthèse du glycogène – clive l’uridine diphosphate glucose, ou UDP-glucose – un sucre nucléotidique – en UDP et en résidus glycosyliques et ajoute le monomère de glucose libéré à la chaîne glycogénique en croissance.

Pour estimer l’activité de la glycogène synthase, commencez par prendre un mélange réactionnel contenant du glycogène, de l’UDP-glucose, de l’ATP, du phosphoénolpyruvate et du nicotinamide adénine dinucléotide, ou NADH, dans un tube. Ajoutez l’enzyme kinase nucléoside diphosphate, ou NDP, et un cocktail d’enzymes pyruvate kinase et lactate déshydrogénase. Mélangez le contenu et incuberez.

Ajouter l’échantillon contenant de la glycogène synthase dans le tube pour initier la réaction enzymatique.

La glycogène synthase agit sur l’UDP-glucose, générant l’UDP et un résidu glycosyle. L’enzyme absorbe le monomère de glucose libre et l’incorpore dans la chaîne glycogène du mélange réactionnel. En présence d’ATP, la kinase NDP du mélange réactionnel phosphoryle l’UDP inutilisé, le convertissant en UTP et générant de l’ADP.

L’enzyme pyruvate kinase agit sur l’ADP et ajoute un phosphate donné par le phosphoénolpyruvate du mélange réactionnel pour produire de l’ATP et du pyruvate. Ensuite, la lactate déshydrogénase convertit le pyruvate en lactate et oxyde le NADH au cours de la réaction.

Mesurez la diminution de l’absorbance du NADH à 340 nm pour quantifier la quantité de NADH consommée, ce qui indique une activité enzymatique réussie.

Pour commencer par la détermination de l’activité de la glycogène synthase, décongelez les solutions mères préalablement préparées de glucose UDP, d’ATP, de phosphoénolpyruvate et de kinase NDP sur de la glace. Préchauffez un bain-marie à 30 degrés Celsius.

Lorsque les solutions mères sont prêtes, préparer un mélange d’essai suffisant en fonction du nombre de dosages de glycogène synthase, en ajoutant les réactifs dans un tube de 15 millilitres, comme décrit dans le protocole textuel.

Préparez une réaction à blanc en remplaçant le NADH du mélange réactionnel par de l’eau, puis transférez la réaction dans une cuvette en méthacrylate jetable. Utilisez la réaction à blanc pour régler « Zéro » sur le spectrophotomètre à la longueur d’onde de 340 nanomètres.

Prenez une aliquote de 770 microlitres du mélange réactionnel dans un tube de 1,5 millilitre, et ajoutez séquentiellement 2 microlitres chacun, du mélange NDP kinase et pyruvate kinase/lactate déshydrogénase dans le tube.

Après avoir mélangé doucement, incubez le tube à 30 degrés Celsius dans le bain-marie, pendant 3 minutes pour préchauffer le mélange réactionnel. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de l’échantillon contenant de la glycogène synthase, dans un tampon Tris de 20 millimolaires à pH 7,8, et mélangez doucement avant de transférer le mélange réactionnel dans une cuvette en méthacrylate jetable.

Placez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance à 340 nanomètres à intervalles réguliers pendant 10 à 20 minutes. Ensuite, tracez les absorbances obtenues en fonction du temps.