Analyse basée sur l’impédance cellulaire pour la surveillance des processus cellulaires en temps réel
JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 3:52 min • July 8th, 2025
Pour la mesure continue du comportement cellulaire à l’aide de l’analyse cellulaire en temps réel, obtenez une plaque de microtitration RTCA contenant des réseaux de microélectrodes en or de mesure d’impédance intégrés dans le fond du puits. Ajoutez délicatement le milieu de culture cellulaire dans les puits.
Dans le milieu électriquement conducteur, appliquez un faible potentiel électrique à travers les microélectrodes. Le potentiel fait circuler le courant électrique entre les microélectrodes, ce qui facilite la mesure de l’impédance de base - la résistance électrique inhérente au fluide.
Pipeter les concentrations souhaitées de suspension de cellules de mammifères dans les puits contenant le milieu. Laissez les cellules se répartir uniformément dans le puits.
Pendant l’incubation, les cellules adhèrent au fond du puits. Les cellules adhérentes sur les microélectrodes agissent comme un isolant, limitant le flux de courant et augmentant l’impédance.
Peu à peu, les cellules prolifèrent sur les microélectrodes, ce qui entraîne une augmentation de l’impédance exponentielle.
Après la formation d’une couche cellulaire confluente, les cellules sont privées de nutriments et meurent. En conséquence, les cellules se détachent des microélectrodes, diminuant l’impédance.
La mesure d’impédance continue facilite la surveillance en temps réel des événements cellulaires, y compris la prolifération et la mort cellulaires.
Pour déterminer la quantité de cellules appropriée pour l’infection cellulaire, préparez des cultures de cellules MDCK confluentes sur 24 heures, comme il a été démontré, avant de laver les cellules avec du PBS et de les récolter avec une incubation de 45 minutes dans 3 millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 % par flacon à 37 degrés Celsius.
Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec 7 millilitres de milieu de culture frais par flacon, et comptez les cellules de chaque culture. Diluez les cellules à 4 x 105 cellules par millilitre de milieu de culture cellulaire et effectuez des dilutions en deux fois en série des cellules, comme indiqué.
Placez une plaque E à température ambiante pendant plusieurs minutes, avant d’ajouter 100 microlitres de milieu de culture cellulaire à chaque puits sans toucher les électrodes de la plaque E. Déverrouillez les berceaux et insérez l’extrémité avant de la plaque dans la poche du berceau de l’instrument de mesure d’impédance. Fermez la porte de l’incubateur et ouvrez le logiciel.
Dans la « Configuration du modèle d’expérience par défaut », mettez en surbrillance les stations d’accueil sélectionnées et double-cliquez sur la page supérieure pour saisir le nom de l’expérience. Cliquez sur « Mise en page » et entrez les informations d’échantillon nécessaires pour chaque puits sélectionné de la plaque. Cliquez sur « Planifier » | « Étapes » | et « Ajouter une étape ». Le logiciel ajoutera automatiquement un pas de 1 seconde pour mesurer l’impédance d’arrière-plan.
Cliquez sur « Exécuter » et « Démarrer / Continuer ». Cliquez sur « Plot » et « Ajouter » pour sélectionner les puits appropriés, en confirmant que l’impédance de fond est comprise entre moins 0,1 et 0,1, avant de passer à l’étape suivante.
Ensuite, retirez la plaque du berceau et ajoutez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les puits appropriés en double. Laissez la plaque E dans la hotte à flux laminaire pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre une répartition uniforme des cellules sur le fond des puits, avant de charger la plaque E dans la poche du berceau. Cliquez sur « Planifier » et « Ajouter une étape », et entrez des valeurs pour surveiller les cellules toutes les 30 minutes pendant 200 répétitions avant de sélectionner « Démarrer / Continuer ».
Pour vérifier et tracer les données d’impédance cellulaire, cliquez sur « Plot » et sélectionnez la concentration de cellules qui se trouve juste avant la phase stationnaire 24 heures après l’ensemencement, afin d’obtenir des cellules qui sont encore en phase de croissance pendant l’infection virale.
Aperçu
Cet article décrit une méthode de mesure continue du comportement cellulaire à l'aide d'une analyse en temps réel des cellules (RTCA). La technique consiste à surveiller les variations d'impédance dans des cultures cellulaires afin d'évaluer la prolifération et la mort cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Analyse cellulaire en temps réel
- Mesure de l'impédance
Contexte
- La RTCA utilise des réseaux de microélectrodes pour la mesure de l'impédance.
- L'adhérence et la prolifération cellulaires influencent l'impédance électrique.
- Le suivi de l'impédance fournit des informations sur les événements cellulaires.
- Le détachement cellulaire est corrélé à la privation de nutriments et à la mort cellulaire.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant la surveillance en temps réel du comportement cellulaire.
- Évaluer les effets de la prolifération et de la mort cellulaire sur l'impédance.
- Déterminer les quantités optimales de cellules pour les études d'infection.
Méthodes utilisées
- Préparation de plaques de microtitration RTCA avec microélectrodes en or.
- Application d'un potentiel électrique pour mesurer l'impédance de base.
- Pipetage de suspensions de cellules de mammifères dans les puits.
- Surveillance continue de l'impédance en fonction du temps.
Résultats principaux
- Une impédance accrue est corrélée à l'adhérence et à la prolifération cellulaires.
- Une impédance réduite indique un détachement et une mort cellulaires.
- Les données en temps réel permettent de surveiller les événements cellulaires.
- Les concentrations cellulaires optimales pour l'infection peuvent être déterminées.
Conclusions
- La RTCA est une méthode efficace pour surveiller le comportement cellulaire.
- Les mesures d'impédance fournissent des informations précieuses sur la dynamique cellulaire.
- La méthode peut être appliquée à divers types cellulaires et conditions.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La surveillance en temps réel de l'impédance permet une évaluation continue et sans marquage des dynamiques cellulaires, offrant des indications prédictives sur la prolifération et la cytotoxicité lors de la validation précoce des cibles. Cette approche facilite la réduction des risques mécanistiques en fournissant des données quantitatives et reproductibles qui éclairent les décisions d'orientation ou d'abandon lors de l'identification des candidats et des flux de travail précliniques. La méthode améliore la pertinence du portefeuille en réduisant l'ambiguïté biologique dans des systèmes pertinents pour la maladie avant des applications aval exigeant des ressources importantes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce au suivi en temps réel des variations d'impédance cellulaire associées à la prolifération et à la mort cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Offre une surveillance continue sans marquage, réduisant la variabilité des tests et facilitant une évaluation cohérente de l'engagement de la cible.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance prédictive en corrélant les profils d'impédance avec l'état physiologique des cellules, contribuant ainsi à l'identification précoce des risques biologiques liés aux cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des sorties d'impédance quantitatives et résolues dans le temps, permettant une évaluation normalisée des effets de composés sur la viabilité et la croissance cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à une collecte automatisée et continue des données sur plusieurs puits réplicats.
- Extensibilité : Prend en charge les flux de travail de criblage à débit moyen en permettant des lectures cinétiques en temps réel, sans fixation finale ni marquage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet une transition fluide entre la découverte et l'évaluation préclinique en assurant un suivi cohérent et sans marquage des réponses cellulaires.
- Réduction des risques mécanistiques : La détection par impédance du détachement et de la mort cellulaire fournit une indication précoce des mécanismes cytotoxiques, guidant ainsi l'avancement ajusté au risque.
- Système pertinent pour la maladie : Applicable aux modèles cellulaires adhérents de mammifères utilisés dans les études sur l'influenza et d'autres pathogénèses virales, soutenant la validation des cibles en matière de maladies infectieuses.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La surveillance en temps réel de l'impédance s'inscrit dans le continuum de la découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification de composés candidats et l'évaluation préclinique, en offrant une résolution cinétique des événements cellulaires qui soutient la prise de décision fondée sur les données à chaque étape.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies en reliant en temps réel la dynamique de l'impédance à la prolifération et à la mort cellulaires.
- Criblage : Offre une prêts-à-l'emploi des tests et des résultats quantitatifs permettant une comparaison fiable des conditions expérimentales à différents points temporels.
- Analytique : Fournit des mesures continues de l'impédance qui permettent aux équipes d'évaluer les réponses cellulaires dans diverses conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte précoce à la continuité préclinique grâce à une surveillance cohérente et sans marquage de la santé cellulaire dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité de plateforme réutilisable dans plusieurs projets, réduisant ainsi le développement redondant de tests et permettant une standardisation inter-équipes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Offre une confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à une surveillance cellulaire en temps réel et sans marquage.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité par des mesures d'impédance automatisées dans des formats multi-puits.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go), l'efficacité du capital et réduit les risques biologiques en phase avancée en permettant une détection précoce des effets cytotoxiques ou prolifératifs.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions de priorisation et d'avancement ajustées au risque en fournissant des données quantitatives et continues sur la dynamique cellulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, en conception de tests basés sur l'impédance et en interprétation en temps réel des données.
- Dépend d'un instrument spécialisé, notamment des plaques de microtitration équipées d'électrodes et des plateformes de mesure de l'impédance.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de semis cellulaire, d'incubation et de collecte des données afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Les considérations relatives à l'adaptation incluent le type cellulaire, les propriétés d'adhérence et la compatibilité avec les électrodes dans différents systèmes modèles.
- Les limites pratiques comprennent la sensibilité aux cellules non adhérentes et les interférences potentielles dues à la présence de composés conducteurs dans le milieu.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
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Dernière mise à jour : 29 août 2026