Analyse basée sur l’impédance cellulaire pour la surveillance des processus cellulaires en temps réel

Pour la mesure continue du comportement cellulaire à l’aide de l’analyse cellulaire en temps réel, obtenez une plaque de microtitration RTCA contenant des réseaux de microélectrodes en or de mesure d’impédance intégrés dans le fond du puits. Ajoutez délicatement le milieu de culture cellulaire dans les puits.

Dans le milieu électriquement conducteur, appliquez un faible potentiel électrique à travers les microélectrodes. Le potentiel fait circuler le courant électrique entre les microélectrodes, ce qui facilite la mesure de l’impédance de base - la résistance électrique inhérente au fluide.

Pipeter les concentrations souhaitées de suspension de cellules de mammifères dans les puits contenant le milieu. Laissez les cellules se répartir uniformément dans le puits.

Pendant l’incubation, les cellules adhèrent au fond du puits. Les cellules adhérentes sur les microélectrodes agissent comme un isolant, limitant le flux de courant et augmentant l’impédance.

Peu à peu, les cellules prolifèrent sur les microélectrodes, ce qui entraîne une augmentation de l’impédance exponentielle.

Après la formation d’une couche cellulaire confluente, les cellules sont privées de nutriments et meurent. En conséquence, les cellules se détachent des microélectrodes, diminuant l’impédance.

La mesure d’impédance continue facilite la surveillance en temps réel des événements cellulaires, y compris la prolifération et la mort cellulaires.

Pour déterminer la quantité de cellules appropriée pour l’infection cellulaire, préparez des cultures de cellules MDCK confluentes sur 24 heures, comme il a été démontré, avant de laver les cellules avec du PBS et de les récolter avec une incubation de 45 minutes dans 3 millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 % par flacon à 37 degrés Celsius.

Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec 7 millilitres de milieu de culture frais par flacon, et comptez les cellules de chaque culture. Diluez les cellules à 4 x 10⁵ cellules par millilitre de milieu de culture cellulaire et effectuez des dilutions en deux fois en série des cellules, comme indiqué.

Placez une plaque E à température ambiante pendant plusieurs minutes, avant d’ajouter 100 microlitres de milieu de culture cellulaire à chaque puits sans toucher les électrodes de la plaque E. Déverrouillez les berceaux et insérez l’extrémité avant de la plaque dans la poche du berceau de l’instrument de mesure d’impédance. Fermez la porte de l’incubateur et ouvrez le logiciel.

Dans la « Configuration du modèle d’expérience par défaut », mettez en surbrillance les stations d’accueil sélectionnées et double-cliquez sur la page supérieure pour saisir le nom de l’expérience. Cliquez sur « Mise en page » et entrez les informations d’échantillon nécessaires pour chaque puits sélectionné de la plaque. Cliquez sur « Planifier » | « Étapes » | et « Ajouter une étape ». Le logiciel ajoutera automatiquement un pas de 1 seconde pour mesurer l’impédance d’arrière-plan.

Cliquez sur « Exécuter » et « Démarrer / Continuer ». Cliquez sur « Plot » et « Ajouter » pour sélectionner les puits appropriés, en confirmant que l’impédance de fond est comprise entre moins 0,1 et 0,1, avant de passer à l’étape suivante.

Ensuite, retirez la plaque du berceau et ajoutez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les puits appropriés en double. Laissez la plaque E dans la hotte à flux laminaire pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre une répartition uniforme des cellules sur le fond des puits, avant de charger la plaque E dans la poche du berceau. Cliquez sur « Planifier » et « Ajouter une étape », et entrez des valeurs pour surveiller les cellules toutes les 30 minutes pendant 200 répétitions avant de sélectionner « Démarrer / Continuer ».

Pour vérifier et tracer les données d’impédance cellulaire, cliquez sur « Plot » et sélectionnez la concentration de cellules qui se trouve juste avant la phase stationnaire 24 heures après l’ensemencement, afin d’obtenir des cellules qui sont encore en phase de croissance pendant l’infection virale.