JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 3:00 min • July 8th, 2025
Lors de l’infection par le virus de la grippe, le virus pénètre dans la cellule par endocytose et détourne la machinerie de la cellule hôte, produisant des virions de descendance. Ceux-ci sont libérés, infectant les cellules voisines, provoquant une cascade d’infections.
Pour mesurer le rapport entre le virus de la grippe infectieuse et les cellules en culture — multiplicité de l’infection —, ajoutez une densité appropriée de suspension de cellules de mammifères fraîchement obtenues dans une plaque de microtitration.
La plaque contient des microélectrodes en or à mesure d’impédance intégrées dans le fond du puits. Incuber, permettant aux cellules d’adhérer au fond du puits et d’atteindre la phase de croissance exponentielle avant l’infection.
Appliquez un petit potentiel électrique entre les microélectrodes. Les cellules collées sur les microélectrodes agissent comme des isolants, limitant le flux de courant et augmentant la résistance électrique (impédance) qui est mesurée.
Retirez le support. Pipeter la suspension du virus de la grippe dans les puits. Complétez avec une endoprotéase à sérine appropriée.
Pendant l’incubation, l’endoprotéase sérine clive et active la glycoprotéine virale hémagglutinine, facilitant sa liaison à des récepteurs spécifiques de la cellule hôte et l’entrée ultérieure des cellules virales.
À l’aide de la machinerie cellulaire hôte, de nouvelles particules virales sont produites et libérées, infectant les cellules voisines. En conséquence, les cellules infectées par le virus subissent des changements morphologiques et présentent des effets cytopathiques, conduisant à la mort cellulaire - les cellules se détachent de la surface des microélectrodes, diminuant l’impédance au fil du temps.
Déterminez le temps nécessaire pour que l’impédance soit réduite de moitié par rapport à l’impédance initiale avant l’ajout du virus. Une période plus courte suggère une multiplicité plus élevée d’infections virales.
Pour déterminer la corrélation entre les valeurs CIT50 et la multiplicité de l’infection, après avoir cultivé 3 x 104 cellules MDCK fraîchement divisées dans chaque paroi de la plaque de microtitration électronique pendant 24 heures, lavez les cellules deux fois avec 100 microlitres de milieu de propagation du virus frais par puits et par lavage, et utilisez une pipette à canal unique pour ajouter 100 microlitres de suspension virale dans chaque puits.
Lorsque toutes les dilutions virales ont été ajoutées, chargez doucement la plaque dans la poche du berceau de l’instrument à 35 degrés Celsius et commencez à surveiller l’impédance de la cellule toutes les 15 minutes pendant au moins 100 heures, comme démontré.
Après deux cycles de mesures, cliquez sur « Mettre en pause » l’appareil et retirez la plaque E du berceau. Ajoutez 100 microlitres de milieu de propagation du virus complété par de la TPCK-trypsine dans chaque puits et remettez la plaque E dans la poche du berceau. Ensuite, lancez l’analyse.