Test de cinétique de survie basé sur l’impédance cellulaire pour évaluer la survie du virus

Les virus se lient au récepteur de la cellule hôte et s’internalisent dans un endosome. La membrane endosomale fusionne avec la membrane virale, libérant le contenu viral à l’intérieur de la cellule.

Lorsqu’il atteint le noyau, le génome viral se transcrit en ARNm et se traduit plus tard en protéines virales. Les composants viraux pénètrent dans le cytoplasme et s’assemblent en virions, qui se pincent hors de la cellule et provoquent des effets cytopathiques – des changements dans la morphologie de la cellule hôte et la mort.

Pour évaluer la cinétique de survie du virus en mesurant l’impédance de la cellule hôte, prenez une plaque multipuits recouverte de microélectrodes de mesure d’impédance à sa base. Ajoutez une suspension de cellule hôte dans les puits et incubez pour permettre aux cellules d’adhérer à la surface de l’électrode et de se développer.

Ensuite, prenez des suspensions virales prétraitées salines avec différentes charges virales. Le traitement salin fournit au virus du chlorure, qui produit de l’acide hypochloreux qui le tue, réduisant ainsi l’infectiosité virale. Ajoutez ces suspensions virales dans leurs puits respectifs.

Mesurez l’impédance cellulaire – un phénomène d’opposition au flux de courant électrique à travers les électrodes – par les cellules adhérentes.

Les virus infectent les cellules hôtes adhérentes et modifient leur morphologie, provoquant le détachement des cellules transformées des électrodes. Au fil du temps, à mesure que d’autres cellules sont infectées, l’impédance cellulaire médiée par la cellule hôte diminue.

Tracez l’indice de cellule, qui est la variation d’impédance due au détachement de cellules infectées, au fil du temps.

Pour évaluer la cinétique de survie du virus de la grippe A, ajoutez du chlorure de sodium à une concentration finale de 35 grammes par litre dans de l’eau distillée, et ajoutez 900 microlitres de la solution saline résultante dans des cryotubes de 2 millilitres. Ajoutez 100 microlitres de stock viral dans chaque cryotube et placez les tubes dans l’incubateur à 35 degrés Celsius, pendant la période expérimentale appropriée.

La veille de la fin de l’incubation, ensemencer 3 x 10⁴ cellules MDCK fraîchement divisées dans 100 microlitres de milieu de propagation du virus par puits, dans une plaque de microtitration de 16 puits, et répéter les étapes permettant de mesurer l’impédance de fond et la répartition uniforme des cellules sur le fond des puits. Ensuite, cultivez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain, lavez les cellules deux fois, puis infectez-les avec 100 microlitres de virus distillé salinement, dilué 10 fois dans un milieu de culture frais, comme démontré, et surveillez l’impédance cellulaire toutes les 15 minutes pendant au moins 100 heures.