Dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique pour évaluer le stress oxydatif dans le sérum humain

Les cellules génèrent de faibles niveaux de radicaux libres au cours des processus métaboliques.

Dans des conditions pathologiques, une surproduction de radicaux libres se produit, provoquant un stress oxydatif. Ces radicaux libres attaquent les acides gras polyinsaturés dans les phospholipides de la membrane cellulaire dans un processus appelé peroxydation lipidique. Cela forme des produits d’oxydation toxiques, notamment des hydroperoxydes lipidiques et du malondialdéhyde (MDA), qui causent des dommages à la membrane et la mort cellulaire.

Pour détecter in vitro le stress oxydatif dans le sérum humain à l’aide du test TBARS (substance réactive à l’acide thiobarbiturique), commencez par un tube contenant du sérum humain traité avec un composé induisant l’oxydation. Le sérum traité comprend principalement des produits de peroxydation lipidique - MDA et hydroperoxydes lipidiques - ainsi que des phospholipides, des lipides et des protéines.

Ensuite, ajoutez du dodécylsulfate de sodium (SDS) et mélangez pour solubiliser les lipides et libérer le MDA. Le SDS dénature toutes les protéines contaminantes. Ajouter un tampon acide approprié, suivi d’acide thiobarbiturique acide (TBA). Incuber à haute température.

Dans des conditions acides et à des températures élevées, les molécules de TBA réagissent avec le MDA, formant un complexe MDA-TBA rouge-rose stable, appelé TBARS. Incuber sur glace pour stopper la réaction et stabiliser les complexes existants.

centrifugeuse. Prélever et transférer le surnageant contenant du MDA-TBA dans une plaque multipuits. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorbance du complexe.

Une absorbance plus élevée suggère une concentration élevée de TBARS, ce qui indique des niveaux plus élevés de produits de peroxydation lipidique et de stress oxydatif dans le sérum.

Étiquetez les tubes en verre pour les échantillons à analyser, puis ajoutez 100 microlitres de l’échantillon préparé dans chaque tube. Ajoutez 200 microlitres de SDS à 8,1 % à chaque échantillon et faites tourner doucement le tube de verre dans un mouvement circulaire pour mélanger.

Ajouter 1,5 millilitre de tampon d’acétate de sodium de 3,5 molaires à chaque échantillon. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitres de solution aqueuse d’acide thiobarbiturique à 0,8 %. Portez le volume final de chaque tube à 4 millilitres en ajoutant 700 microlitres d’eau déminéralisée. Fermez hermétiquement les tubes de verre et incubez-les dans un bloc chauffant réglé à 95 degrés Celsius pendant 1 heure. Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pour éviter la condensation. Ensuite, retirez les tubes du bloc et incubez-les sur de la glace pendant 30 minutes.

Après l’incubation, centrifuger les échantillons et les étalons à 1 500 x g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Transférez 150 microlitres de surnageant de chaque tube dans un puits dans une plaque de 96 puits, en éliminant toutes les bulles d’air avec une pointe de pipette.

Mesurer l’absorbance des échantillons à 532 nanomètres. Ensuite, soustrayez la lecture d’absorbance moyenne des échantillons à blanc de toutes les autres lectures d’absorbance.

Créez une courbe standard et utilisez-la pour calculer des concentrations d’échantillons inconnues.