Essai de germination choroïde pour étudier la prolifération microvasculaire oculaire ex vivo

JoVE Encyclopedia of Experiments

Techniques biologiques

0 vues • 3:48 min • July 8th, 2025

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Dans l’œil des mammifères, la choroïde, située entre la sclérotique et la rétine, contient des macrophages périvasculaires et le choriocapillaire - une couche de capillaires sanguins tapissée de péricytes qui fournit de l’oxygène et des nutriments à la rétine. La formation anormale de vaisseaux sanguins à partir de la choriocapillaire se produit dans plusieurs maladies oculaires vasculaires.

Pour étudier la dysrégulation du choriocapillaire germinant ex vivo, prélevez des explants d’yeux de souris contenant la choroïde attachée à la sclérotique et à l’épithélium pigmentaire rétinien, ou EPR.

Ajoutez des gouttelettes d’extrait de membrane basale, ou BME – un hydrogel enrichi en protéines de la matrice extracellulaire – dans les puits d’une plaque multi-puits. Placez les explants dans la gouttelette, en évitant l’aplatissement des tissus. Laissez le BME se solidifier.

Ajouter un milieu complété par des cellules endothéliales ou des facteurs de croissance spécifiques à la CE. Couver. L’EPR sécrète un facteur de croissance endothéliale vasculaire qui, parallèlement aux facteurs de croissance spécifiques à la CE, stimule la prolifération capillaire de la CE.

Le BME solidifié forme une matrice extracellulaire qui favorise la prolifération des CE pour former des tubules capillaires germinants. Les péricytes migrent et se fixent à ces capillaires germinants, facilitant la maturation des CE capillaires.

Les macrophages activés dans la région de germination sécrètent des enzymes pour digérer la membrane de Bruch – la couche choroïdienne la plus interne – qui permet aux germes de migrer dans l’EPR.

Au microscope, visualisez les capillaires en germination. À l’aide d’un logiciel approprié, mesurez la surface couverte par la pousse choroïde.

Une plus grande zone de germination choroïdienne indique une germination choriocapillaire progressive dans l’explant.

Ajoutez 30 microlitres de BME décongelé au centre de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Assurez-vous que la gouttelette de BME forme un dôme convexe au bas de la plaque sans toucher les bords.

Placez le tissu au milieu de l’abdomen. N’aplatissez pas l’explant choroïde. Laissez le tissu se dilater à l’intérieur de l’EMO. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour laisser le gel se solidifier. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu classique complet dans chaque puits. Changez le support classique tous les deux jours.

La germination de la choroïde peut être observée après trois jours au microscope. Ouvrez l’image de germination de la choroïde avec l’image J et vérifiez "Image | Type | et 8 bits" avec niveaux de gris. Optimisez ensuite le contraste en sélectionnant « Image | Ajuster | Luminosité/Contraste" et de l’ajuster.

Utilisez la fonction « Baguette magique » pour délimiter et retirer le tissu choroïde, qui est présent au centre des pousses. Supprimez l’arrière-plan de l’image avec les outils de sélection gratuits.

Ensuite, allez dans "Image | Ajuster | Seuil » et utilisez la fonction « Seuil » pour définir les pousses microvasculaires sur l’arrière-plan et la périphérie. Cliquez sur « F2 » et un résumé apparaîtra. Cliquez sur « Enregistrer » pour enregistrer une image de la zone sélectionnée dans le même dossier que l’image d’origine pour référence future.

Une fois qu’un groupe d’échantillons a été mesuré, copiez les données enregistrées pour l’analyse.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026