Transfert d’énergie par résonance de Forster résolu dans le temps pour la surveillance de la phosphorylation des protéines dans les cellules

La phosphorylation de certaines protéines cellulaires est un mécanisme de régulation clé qui conduit à leur activation ou désactivation.

Pour surveiller la phosphorylation spécifique des protéines, prenez une plaque de culture contenant des cellules adhérentes. Traitez les cellules avec un stimulateur pour favoriser la phosphorylation des protéines dans les cellules. Aspirez le milieu épuisé et ajoutez un tampon de lyse cellulaire et un cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase.

Les composants tampons provoquent la lyse cellulaire, libérant le contenu cellulaire ainsi que les protéines phosphorylées et non phosphorylées. Le cocktail inhibiteur inactive la phosphatase cellulaire, de sorte que les protéines phosphorylées restent intactes.

Transférez le lysat cellulaire dans une plaque de détection à faible volume. Traitez le lysat avec les anticorps donneurs et accepteurs attachés à différents fluorophores sensibles à la lumière.

Pendant l’incubation, les anticorps du donneur reconnaissent un épitope spécifique sur la protéine testée, ce qui leur permet de se lier aux variantes phosphorylées et non phosphorylées de la protéine. En revanche, les anticorps accepteurs se lient exclusivem