Essai de complémentation de la luciférase fractionnée pour identifier des interactions protéine-protéine spécifiques

Les interactions protéine-protéine sont cruciales pour les fonctions cellulaires vitales.

Pour étudier les interactions entre les protéines transmembranaires – protéines membranaires qui couvrent la bicouche lipidique de la membrane cellulaire, commençons par les puits d’une plaque multipuits contenant une culture de cellules de mammifères adhérente.

Ensuite, ajoutez une solution contenant un agent de transfection approprié et une paire de plasmides d’expression.

L’un des plasmides d’expression code pour une protéine transmembranaire d’intérêt fusionnée au petit fragment non fonctionnel de l’enzyme luciférase ; l’autre plasmide code pour une seconde protéine transmembranaire d’intérêt fusionnée au grand fragment non fonctionnel de l’enzyme luciférase.

Incuber l’assiette. L’agent de transfection facilite l’absorption cellulaire des plasmides d’expression.

Les cellules transfectées avec succès expriment les protéines transmembranaires. L’interaction entre les protéines transmembranaires exprimées rapproche les petits et les grands fragments faisant face au cytoplasme, ce qui les amène à se lier et à former l’enzyme luciférase active.

Remplacez le milieu dans les puits par un milieu sans sérum pour minimiser la luminescence de fond. Ajouter une solution de furimazine - un substrat de luciférase perméable aux cellules. La furimazine pénètre dans les cellules, après quoi la luciférase oxyde la furimazine, générant une luminescence de haute intensité.

À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez la luminescence, ce qui suggère une forte interaction entre les protéines transmembranaires.

Récoltez l’adhérent HEK293T culture cellulaire par trypsinisation, et remettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance complet dédié. Plaquez les cellules sur une plaque à 96 puits à fond transparent, côté blanc. Ajustez le nombre total de puits pour tenir compte de toutes les combinaisons et de tous les contrôles testés, y compris les répétitions. Ensuite, cultivez les cellules pendant la nuit dans des conditions standard.

Le lendemain, transfectez les cellules avec les combinaisons souhaitées de plasmides d’expression. Diluez les plasmides dans un milieu sans sérum à 6,25 nanogrammes par microlitre pour chaque construction, et ajoutez le réactif de transfection à base de lipides à un rapport lipide/ADN approprié.

Incuber les plasmides selon les instructions du fabricant. Ensuite, ajoutez 8 microlitres du mélange lipide-ADN dans les puits désignés. Mélangez le contenu de la plaque avec une rotation douce et cultivez les cellules pendant 20 à 24 heures dans des conditions standard.

Le lendemain, remplacez le milieu conditionné dans chaque puits par 100 microlitres d’un milieu sans sérum, en vous assurant que les cellules ne se détachent pas lors de l’échange de milieu.

Juste avant de mesurer la luminescence, mélangez un volume de furimazine avec 19 volumes d’un tampon de dilution. Ajoutez 25 microlitres de la solution de travail de furimazine dans chaque puits et mélangez doucement la plaque à la main ou avec un agitateur orbital.

Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques à luminescence et équilibrez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Sélectionnez les puits à analyser, et lisez la luminescence avec un temps d’intégration de 0,3 seconde. Continuez à surveiller la luminescence jusqu’à deux heures si nécessaire.