JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:34 min • July 8th, 2025
La PCR numérique par gouttelettes détecte les mutations indelles, c’est-à-dire l’insertion ou la suppression aléatoire de nucléotides dans l’ADN. Ceci est réalisé en divisant l’échantillon en minuscules gouttelettes et en amplifiant indépendamment l’ADN dans chaque gouttelette.
Pour effectuer la ddPCR, prélevez un échantillon d’ADN contenant des variations de type sauvage et mutantes du gène cible. Chargez le mélange d’échantillons et l’huile dans des compartiments distincts de la chambre du générateur de gouttelettes contenant le canal microfluidique.
L’échantillon et l’huile s’écoulent rapidement à travers les canaux étroits, s’émulsionnent à la jonction et sont divisés en plusieurs gouttelettes, chacune contenant quelques molécules d’ADN.
Maintenant, prenez une plaque PCR avec le tampon contenant des amorces avant et arrière, des dNTP, de l’ADN polymérase thermostable et deux sondes marquées avec des fluorophores et des molécules d’extinction différents. Chaque sonde est spécifique à un type particulier d’allèle – de type sauvage ou mutant.
Transférez les gouttelettes sur la plaque PCR. Placez la plaque dans un thermocycleur et lancez la réaction. Lors de la dénaturation, les brins d’ADN se séparent. À la température de recuit, les amorces et les sondes recuit à l’ADN matrice.
La sonde avec des fluorophores verts et orange se lie respectivement à la séquence d’ADN de type sauvage et mutant. Plus tard, l’ADN polymérase étend les amorces, clivant les molécules de fluorophore et de trempe de la sonde, générant un signal de fluorescence.
Analysez le produit amplifié. Les gouttelettes présentant une fluorescence verte contiennent la séquence d’ADN de type sauvage, tandis que la fluorescence orange indique la mutation indel.
Pour commencer, préparez 25 microlitres du mélange d’échantillons PCR ou ddPCR en gouttelettes numériques en ajoutant du super mélange ddPCR, des amorces directes et inverses, des sondes HEX ou FAM, de l’ADN et de l’eau dans les proportions décrites dans le texte. Ensuite, mélangez soigneusement la réaction par vortex.
À l’aide d’une pipette multicanaux de 50 microlitres, chargez 20 microlitres du mélange d’échantillons ddPCR dans la rangée centrale de la cartouche. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux de 200 microlitres pour charger 70 microlitres d’huile dans la rangée inférieure sans générer de bulles tout au long du pipetage.
Placez le joint en ne touchant que les bords, en évitant la zone concave centrale, puis placez la plaque en toute sécurité dans le générateur de gouttelettes et fermez le couvercle pour commencer la course.
Pour transférer le mélange d’immersion de la rangée supérieure de la cartouche dans la plaque à 96 puits, utilisez une pipette multicanaux et prélevez 40 microlitres d’échantillon liquide pendant 3 à 5 secondes à un angle de 30 à 45 degrés. Ensuite, expulsez lentement le mélange dans le puits pendant plus de 3 secondes à un angle de 45 degrés, en le laissant tomber sur le côté, puis passez au deuxième arrêt de la pipette pour expulser complètement le liquide. À l’aide de thermoscellages en aluminium, scellez les plaques pendant 5 secondes à 180 degrés Celsius.
Placez la plaque scellée dans le thermocycleur et définissez les conditions PCR pour les directives NHEJ Drop-Off en réglant la dénaturation initiale à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, réglez 40 cycles de 94 degrés Celsius pendant 30 secondes pour dénaturer, 55 degrés Celsius pendant 1 minute pour recuire et 60 degrés Celsius pendant 2 minutes pour étendre.
Après 40 cycles, réglez le maintien à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes et le maintien final à 4 degrés Celsius. Utilisez une rampe de 2 degrés Celsius par seconde pour tous les pas. La température de recuit variera en fonction des sondes ou de l’apprêt utilisés. Placez la plaque en toute sécurité dans le lecteur de gouttelettes avec le A1 bien étiqueté en haut à gauche.
Ouvrez le programme et configurez la plaque en désignant FAM comme canal de référence connu et HEX comme canal inconnu pour chaque puits. Ensuite, modifiez le nom de chaque échantillon. Exécutez l’expérience de lecture des gouttelettes en tant que quantification directe tout en enregistrant le modèle.