Réaction en chaîne par polymérase à gradient pour déterminer la température de recuit optimale

La réaction en chaîne par polymérase à gradient est une technique permettant d’optimiser la température de recuit à laquelle les amorces (ADN simple brin spécifique à la séquence) se lient aux sites complémentaires de l’ADN matrice.

Prenez un mélange contenant des amorces directes et inverses, des dNTP et de l’ADN polymérase thermostable dans un tampon approprié. Ajoutez l’ADN matrice et transférez les constituants dans une plaque PCR.

Placez la plaque dans un thermocycleur à gradient avec un bloc chauffant spécialisé. Cela permet d’établir un gradient linéaire de température de recuit entre 55 °C et 65 °C, avec une augmentation constante de la température sur l’ensemble de la plaque.

La réaction chauffe la plaque à haute température, dénaturant l’ADN double brin en simple brin et activant l’ADN polymérase. Plus tard, la température est abaissée en fonction des valeurs programmées dans chaque puits, ce qui facilite le recuit d’amorçage.

À une température de recuit inférieure à la température optimale, les amorces se lient de manière non spécifique à l’ADN dénaturé, ce qui entraîne une amplification non spécifique pendant la réaction de PCR. À une température supérieure à la tempéra