Réaction en chaîne par polymérase à gradient pour déterminer la température de recuit optimale

La réaction en chaîne par polymérase à gradient est une technique permettant d’optimiser la température de recuit à laquelle les amorces (ADN simple brin spécifique à la séquence) se lient aux sites complémentaires de l’ADN matrice.

Prenez un mélange contenant des amorces directes et inverses, des dNTP et de l’ADN polymérase thermostable dans un tampon approprié. Ajoutez l’ADN matrice et transférez les constituants dans une plaque PCR.

Placez la plaque dans un thermocycleur à gradient avec un bloc chauffant spécialisé. Cela permet d’établir un gradient linéaire de température de recuit entre 55 °C et 65 °C, avec une augmentation constante de la température sur l’ensemble de la plaque.

La réaction chauffe la plaque à haute température, dénaturant l’ADN double brin en simple brin et activant l’ADN polymérase. Plus tard, la température est abaissée en fonction des valeurs programmées dans chaque puits, ce qui facilite le recuit d’amorçage.

À une température de recuit inférieure à la température optimale, les amorces se lient de manière non spécifique à l’ADN dénaturé, ce qui entraîne une amplification non spécifique pendant la réaction de PCR. À une température supérieure à la température optimale, des quantités insuffisantes d’amorces se lient à l’ADN.

À température optimale, les amorces se lient spécifiquement à l’ADN cible. Ensuite, la température augmente légèrement, ce qui permet à la polymérase d’étendre les amorces à l’aide de dNTP. Ces cycles répétitifs de dénaturation, de recuit et d’extension conduisent à l’amplification de l’ADN.

Analysez le produit dans chaque puits. Les puits avec des températures de recuit non optimales présentent une amplification moindre ou non spécifique.

Une température de recuit optimale produit l’amplification spécifique maximale de l’ADN.

Pour effectuer une PCR de gradient, commencez par préparer un master mix. Ensuite, prélevez 19 microlitres du mélange principal pour le contrôle sans modèle, ou NTC, dans une plaque à 96 puits. Ensuite, ajoutez le modèle au mixage principal restant. Aliquote 20 microlitres de l’échantillon mélangés dans la plaque de 96 puits. Effectuer une PCR en suivant les paramètres de cyclage, puis générer les profils de fusion thermique, en utilisant les paramètres mentionnés dans le manuscrit.