PCR quantitative à transcription inverse en temps réel pour le diagnostic des infections virales

La PCR quantitative de transcription inverse en temps réel est utile pour identifier les infections virales.

Commencez par un échantillon contenant l’ARN viral cible. Ajoutez des amorces spécifiques à la cible, qui aident à la fois à la synthèse et à l’amplification de l’ADN, ainsi que l’enzyme transcriptase inverse et les dNTP.

Ajoutez de l’ADN polymérase thermostable - une enzyme permettant d’amplifier l’ADN à travers les cycles de PCR - et du vert SYBR - un colorant qui s’intercale dans l’ADN double brin, l’ADNdb. Placez la réaction dans un thermocycleur. Réglez une température appropriée pour que les amorces se lient à l’ARN cible.

La transcriptase inverse ajoute des dNTP à l’amorce tout en clivant simultanément l’ARN matrice, synthétisant ainsi l’ADNc.

Augmentez la température, en inactivant la transcriptase inverse. Abaissez la température, ce qui permet aux amorces de se recuire sur l’ADNc pour une amplification ultérieure. Augmentez la température pour atteindre l’étape d’extension, où l’ADN polymérase étend les amorces, synthétisant l’ADNdb.

Des cycles consécutifs entraînent une amplification exponentielle de l’ADNdb. Le vert SYBR se lie à l’ADN en nombre croissant, provoquant une augmentation proportionnelle de l’émission de fluorescence. Tracez le signal de fluorescence détecté sur l’ensemble des cycles.

Une courbe d’amplification positive indique la présence d’ARN viral dans l’échantillon.

Augmentez la température progressivement pour atteindre la température de fusion, dénaturant l’ADNdb en brins uniques. Les molécules de colorant liées sont libérées, perdant leur fluorescence. Tracez la fluorescence décroissante en fonction de la température.

Un pic correspondant à la température de fusion spécifique au virus confirme l’infection virale.

Planifiez la disposition de votre plaque PCR à l’aide d’une feuille de calcul, en tenant compte à la fois des échantillons de test et de contrôle. Préparez un poste de travail PCR en désinfectant les surfaces, et si vous utilisez une armoire UV, allumez la lumière UV 10 minutes avant de commencer.

Retirez les réactifs et les amorces du congélateur pour les décongeler, mais gardez le mélange d’enzymes sur de la glace en tout temps. Mélangez les réactifs et centrifugez brièvement pour recueillir le liquide. Préparez des mélanges maîtres PCR pour le lyssavirus et la bêta-actine, selon les instructions du manuscrit. Laissez les master-mixes sur de la glace jusqu’au moment de les utiliser. Mélangez et centrifugez les mélanges maîtres préparés, et distribuez 19 microlitres dans les puits correspondants de la plaque ou de la bande tubulaire compatible avec la machine PCR.

Dans une pièce séparée ou une armoire UV, ajoutez soigneusement 1 microlitre de l’ARN préparé. Si vous utilisez une armoire UV, allumez la lumière UV 10 minutes avant de commencer. Après les échantillons de test, ajoutez le contrôle positif et le contrôle sans modèle.

Lorsque vous ajoutez l’ARN aux mélanges maîtres, assurez-vous qu’il est ajouté au bon puits. Utilisez le plan de plaque pour faciliter cette étape.

Scellez la plaque, en vérifiant que les couvercles sont à plat sur la plaque, et faites-la tourner pour recueillir tout le liquide au fond des puits. Assurez-vous que chaque puits a le même volume de liquide et qu’aucune bulle n’est visible. Ensuite, transférez les échantillons dans la machine PCR.

Ouvrez le programme en choisissant « SYBR Green » avec « Dissociation ». Sélectionnez les puits à analyser, en choisissant « Inconnu » comme type d’échantillon et « SYBR » comme colorant fluorescent. Étiquetez les puits sur la disposition de la plaque avec les informations sur l’échantillon, y compris si le test est pour le puits de lyssavirus ou la bêta-actine.

Cliquez sur « Configuration du profil thermique » et modifiez les conditions de cycle thermique comme spécifié dans le manuscrit. Cliquez sur « Démarrer », puis choisissez un emplacement pour enregistrer le fichier et cochez la case pour éteindre la lampe à la fin de la course. Lorsque l’option permettant de démarrer avant le préchauffage de la lampe apparaît, cliquez sur « Exécuter maintenant », mais assurez-vous que la lampe a moins de 15 minutes pour se réchauffer.