Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
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La PCR quantitative de transcription inverse en temps réel est utile pour identifier les infections virales.
Commencez par un échantillon contenant l’ARN viral cible. Ajoutez des amorces spécifiques à la cible, qui aident à la fois à la synthèse et à l’amplification de l’ADN, ainsi que l’enzyme transcriptase inverse et les dNTP.
Ajoutez de l’ADN polymérase thermostable - une enzyme permettant d’amplifier l’ADN à travers les cycles de PCR - et du vert SYBR - un colorant qui s’intercale dans l’ADN double brin, l’ADNdb. Placez la réaction dans un thermocycleur. Réglez une température appropriée pour que les amorces se lient à l’ARN cible.
La transcriptase inverse ajoute des dNTP à l’amorce tout en clivant simultanément l’ARN matrice, synthétisant ainsi l’ADNc.
Augmentez la température, en inactivant la transcriptase inverse. Abaissez la température, ce qui permet aux amorces de se recuire sur l’ADNc pour une amplification ultérieure. Augmentez la température pour atteindre l’étape d’extension, où l’ADN polymérase étend les amorces, synthétisant l’ADNdb.
Des cycles consécutifs entraînent une amplification exponentielle de l’ADNdb. Le vert SYBR se lie à l’ADN en nombre croissant, provoq
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