Réaction en chaîne de la polymérase quantitative pour dénombrer les bactériophages

Pour énumérer les bactériophages par réaction en chaîne par polymérase quantitative, qPCR, obtenez un cocktail de réaction qPCR contenant de l’ADN polymérase Taq, des amorces, des désoxynucléotides triphosphates (dNTP) et des molécules de colorant rapporteur fluorescent dans un tampon optimisé. Transférer dans les puits d’une plaque qPCR.

Ajouter des bactériophages traités thermiquement. Le traitement thermique libère l’ADN des bactériophages à partir des particules de bactériophages. Scellez la plaque en empêchant l’évaporation du mélange. Chargez la plaque dans le système qPCR, en réglant les conditions de cycle appropriées.

Le chauffage à des températures élevées dénature l’ADN double brin en brins simples. Il active également l’ADN polymérase Taq. Le recuit provoque la liaison d’amorces spécifiques à la séquence aux brins d’ADN complémentaires du bactériophage. L’extension permet à l’ADN polymérase Taq activée d’ajouter des dNTP à l’extrémité 3' de l’amorce, prolongeant le brin d’ADN en croissance dans la direction 5' à 3'.

Les molécules de colorant s’intercalent dans l’ADN double brin nouvellement synthétisé, provoquant une augmentation de l’intensité de la fluorescence. Chaqu