PCR de fusion à haute résolution pour déterminer les variations de séquence dans les séquences d’ADN mutant

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Techniques biologiques

0 vues • 4:09 min • July 8th, 2025

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La réaction en chaîne par polymérase fondue à haute résolution, HRM-PCR, détecte les variations de séquence d’ADN double brin et d’ADNdb avec une grande précision.

Commencez par un mélange maître contenant de la Taq polymérase inactive, des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP) et le colorant rapporteur fluorescent. Ajoutez les amorces avant et arrière. Pipetez le mélange dans les puits d’une plaque PCR.

Ajoutez le modèle d’ADNdb. Scellez la plaque en empêchant l’évaporation du mélange. Commencez la PCR.

La température de dénaturation élevée dénature l’ADNdb en ADN simple brin, l’ADNsb, et active la polymérase. La réaction est ensuite refroidie à la température de recuit, facilitant la liaison des amorces avant et inverse aux ADNsb via un appariement de bases complémentaires spécifique au site.

La polymérase activée est recrutée, ce qui prolonge le duplex de l’amorce d’ADN par l’ajout de dNTP.

Le colorant rapporteur fluorescent – un colorant spécifique de l’ADNdb présent à des concentrations saturées – s’intercale dans l’ensemble du duplex, devenant fluorescent vivement. Le duplex subit plusieurs cycles de PCR, produisant plusieurs fragments contenant des variants.

Après la PCR, effectuez une analyse de la courbe de fusion en augmentant à nouveau la température de réaction régulièrement au fil du temps.

Selon la séquence nucléotidique, le site contenant la variante peut d’abord se dénaturer, libérant le colorant. Comme les sites de liaison du colorant restants sont saturés, le colorant ne parvient pas à se réintercaler, ce qui réduit l’intensité de la fluorescence. De plus, l’ADNdb se dissocie en ADNsb lors d’un chauffage incrémentiel.

Identifiez la température de fusion, à laquelle la moitié de l’ADNdb se dénature en ADNsb avec une forte diminution de la fluorescence. Un décalage de la courbe de fusion des fragments d’ADN amplifiés identifie les variations de la séquence nucléotidique de l’échantillon.

Pour réaliser le protocole HRM-PCR, il faut d’abord diluer les échantillons d’ADN dans des tubes de 1,5 millilitre avec de l’eau à une concentration de 10 nanogrammes par microlitre. Ensuite, diluez les solutions d’amorçage décongelées dans des tubes de 1,5 millilitre avec de l’eau à la même concentration de 6 micromolaires. Décongelez les solutions de kits HRM-PCR et mélangez soigneusement par vortex pour assurer la récupération de tout le contenu.

Faites tourner brièvement les trois flacons contenant un mélange enzymatique avec un colorant de liaison à l’ADN, du chlorure de magnésium et de l’eau dans une microcentrifugeuse avant de les ouvrir. Dans un tube de 1,5 millilitre à température ambiante, utilisez les composants pour préparer le mélange PCR pour une réaction de 120 microlitres, comme décrit dans le protocole de texte. Mélanger soigneusement par vortex.

Il est essentiel que vous travailliez avec attention, navigation, conformément aux bonnes pratiques en biologie moléculaire.

Pipette 19 microlitres du mélange PCR dans chaque puits d’une plaque multipuits blanche. Ajoutez 1 microlitre de matrice d’ADN ajustée en concentration, puis scellez la plaque multipuits blanche avec une feuille d’étanchéité. Centrifuger la plaque multipuits blanche pendant 1 minute à 1500 fois g dans une centrifugeuse à godet oscillant standard contenant un rotor pour plaques multipuits avec des adaptateurs appropriés. Chargez la plaque multipuits blanche dans l’instrument HRM-PCR. Démarrez le programme HRM-PCR avec les conditions de PCR trouvées dans le protocole texte.

Après la réaction HRM-PCR, effectuez une analyse HRM pour déterminer le polymorphisme de longueur CR1, comme décrit dans le protocole texte.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026