Réaction en chaîne par polymérase multiplex pour détecter la méthylation de l’ADN dans les leucocytes

La méthylation des résidus de cytosine de l’ADN est une caractéristique des leucocytes ou des globules blancs.

La réaction en chaîne par polymérase par gouttelettes multiplexes, ou mdPCR, permet l’identification simultanée de plusieurs régions d’ADN méthylées dans les leucocytes.

Préparez un mélange contenant un tampon de réaction, de l’ADN polymérase et de l’eau sans nucléases. Ajoutez des amorces avant et inverse et des sondes d’hydrolyse fluorescentes spécifiques à chaque région cible. Les sondes comprennent des rapporteurs fluorophores de couleurs différentes liés à des extincteurs pour inhiber l’émission de fluorescence.

Ajoutez de l’ADN converti au bisulfite, dans lequel les cytosines non méthylées sont désaminées en uraciles tandis que les cytosines méthylées restent inchangées. Mélanger.

Remplissez une seringue en verre avec un mélange d’huile de support et de tensioactif et une autre avec un mélange d’huile de support et de PCR, et connectez-les au générateur de gouttelettes microfluidique. Le mélange PCR aqueux s’émulsionne en gouttelettes de la taille d’un nanolitre. Le tensioactif stabilise l’émulsion et empêche la fusion des gouttelettes.

Collectez les gouttelettes et effectuez une PCR. À l’intérieur de chaque gouttelette, la température de dénaturation élevée dénature l’ADN double brin en ADN simple brin et active la polymérase. La température de réaction est abaissée, ce qui permet un recuit spécifique au site des amorces et des sondes.

Comme la polymérase se lie et étend l’amorce d’ADN duplex, les uraciles s’amplifient en thymines, tandis que les cytosines méthylées s’amplifient en tant que cytosines, permettant de distinguer les régions méthylées et non méthylées. La polymérase clive davantage et libère le rapporteur de la sonde, provoquant une émission de fluorescence.

Post-PCR, visualisez les gouttes au microscope. La couleur de fluorescence indique la présence de cibles spécifiques d’ADN méthylé.

Pour la génération de gouttelettes, mélangez 1 microlitre d’ADN converti au bisulfite avec un mélange maître de sonde fraîchement préparé dans un tube PCR, et prélevez l’échantillon avec une brève centrifugation. Utilisez des raccords en PEEK pour connecter des tubes fluidiques jetables à deux seringues en verre de précision d’un volume de 250 microlitres, et pré-remplissez une seringue en verre de précision avec 250 microlitres d’huile de support contenant 5 % de tensioactif fluoré, et une seringue en verre de précision avec 50 microlitres d’huile de support.

Lorsque les deux seringues ont été chargées, chargez 100 microlitres du mélange PCR dans la seringue d’huile de support et placez un dispositif microfluidique à gouttelettes sur la platine d’un microscope optique vertical équipé d’une caméra à grande vitesse.

Pour l’observation et l’enregistrement de la formation de gouttelettes en temps réel, placez les seringues préremplies sur un pousse-seringue programmable et utilisez le raccord PEEK avec raccords pour connecter le tube des seringues au tube des canaux d’entrée respectifs du dispositif microfluidique à gouttelettes.

Placez le tube de la sortie du générateur de gouttelettes à l’intérieur d’un tube PCR de 0,5 millilitre et ajustez le débit de la pompe à seringue à 2 microlitres par minute. Laissez la taille des gouttelettes se stabiliser avant de recueillir l’émulsion résultante. Collectez lentement et soigneusement l’émulsion par le haut du tube et transférez 75 microlitres de la solution dans un tube PCR de 200 microlitres pour le cycle thermique.

Ensuite, vérifiez que la teneur en huile dans le tube PCR correspond étroitement au volume de la phase dispersée pour éviter la coalescence des gouttelettes pendant le cycle thermique, et placez le tube de 200 microlitres dans le thermocycleur.