PCR numérique basée sur une puce dans un tube pour la quantification de variants nucléotidiques uniques

JoVE Encyclopedia of Experiments

Techniques biologiques

0 vues • 4:32 min • July 8th, 2025

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La réaction en chaîne par polymérase numérique (dPCR) est utile pour quantifier les variants mononucléotidiques (SNV), une mutation où la substitution d’un seul nucléotide à une position spécifique du génome crée deux variations nucléotidiques ou allèles.

Pour commencer la quantification à l’aide de la technique dPCR chip-in-a-tube, prélevez un échantillon d’ADN contenant des SNV - l’allèle mutant et l’allèle de type sauvage correspondant. Ajoutez un mélange contenant une enzyme d’ADN polymérase thermostable, des dNTP et des amorces.

Ensuite, ajoutez des sondes oligonucléotidiques spécifiques à l’allèle – marquées avec des rapporteurs de fluorescence de différentes couleurs pour distinguer les allèles – et une molécule de trempage. La proximité de l’extincteur avec le rapporteur supprime sa fluorescence.

Répartissez la solution dans les chambres de réaction d’une puce microfluidique. Chaque chambre contenant un allèle sert de récipient de réaction indépendant.

Placez le tube avec la puce à l’intérieur d’un thermocycleur et démarrez la réaction. À haute température, l’ADN double brin se dénature en simple brin. Abaisser la température de recuit des amorces et des sondes oligonucléotidiques dans leurs régions complémentaires.

À une température d’extension appropriée, l’ADN polymérase étend les amorces et clive la sonde. La distance par rapport à l’extincteur permet l’émission de fluorescence du journaliste.

Lisez les signaux de fluorescence de différentes couleurs et créez un tracé de position pour détecter les chambres contenant les allèles.

Pour déterminer la fréquence de l’allèle mutant – la fraction de l’allèle variant – calculez le rapport entre les chambres contenant l’allèle mutant et l’allèle de type sauvage.

Ajoutez des amorces, des sondes et de l’ADN génomique précédemment conçus à une nouvelle bandelette de 8 tubes, pour atteindre un volume total de 15 microlitres. Pipeter de haut en bas pour mélanger.

Ajoutez la plate-forme de chargement sur les copeaux intégrés dans la nouvelle bande de 8 tubes, puis placez la bande de tubes dans le chargeur automatique. Assurez-vous qu’il y a un contact entre les copeaux et la plate-forme de chargement. Ensuite, placez le curseur de chargement dans la plate-forme et utilisez un butoir pour maintenir le curseur hors du chargeur. Pipetez 15 microlitres du mélange PCR près de l’extrémité du curseur, puis appuyez sur le bouton du chargeur pour faire fonctionner le chargeur pendant 1 minute.

Retirez la bande tubulaire du chargeur après le passage et placez-la dans un activateur d’étanchéité. Poussez avec précaution le couvercle coulissant et le bord du couvercle supérieur. Faites fonctionner l’activateur d’étanchéité pendant environ 2 minutes. Si l’étanchéité est incomplète, indiquée par une flaque de liquide, répétez le passage pendant une minute supplémentaire.

Ajoutez 230 microlitres de liquide d’étanchéité dans les tubes. Placez la bande tubulaire dans le thermocycleur et exécutez la PCR comme décrit dans le protocole. S’il y a une répartition inégale des cloisons positives, ajustez la température ou la durée de la PCR.

Pour détecter et analyser l’intensité de fluorescence des produits de PCR, placez la bande de tube sur le gabarit de détection et ajoutez 6 millilitres d’eau distillée. Éliminez toutes les bulles d’air visibles à l’aide d’une pointe de pipette.

Chargez le gabarit dans le détecteur. Dans le logiciel de détection, sélectionnez les onglets « Fluorescence », « Expérience », puis « Échantillon/NTC », puis cliquez sur le bouton « Exécuter » pour démarrer l’exécution. Une fois l’exécution terminée, confirmez le tracé de position, l’histogramme et le nuage de points 2D.

Pour recueillir le produit PCR, retirez le liquide d’étanchéité du tube. Ajoutez 100 microlitres de tampon TE et agitez vigoureusement pendant 30 secondes. Centrifugez brièvement les tubes dans une centrifugeuse de table, et procédez comme décrit dans le protocole textuel, pour terminer le prélèvement du produit PCR.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026