Transfert de points quantitatif pour estimer les protéines cibles dans un lysat tissulaire

Le transfert de points quantitatif (QDB) est une technique utile pour quantifier la concentration de protéines cibles dans un échantillon. Une fois l’échantillon immobilisé sur une membrane polymère, les protéines peuvent être détectées par immunoblottage.

Pour commencer, prenez une plaque QDB - une plaque multi-puits avec une membrane de nitrocellulose fixée au fond de chaque puits. Ajoutez l’échantillon – un lysat tissulaire contenant la protéine cible – au centre de la membrane à l’intérieur du puits.

Laissez sécher l’échantillon. La protéine cible se lie à la membrane via des interactions non covalentes.

Ajoutez une solution de blocage. Les protéines de la solution se fixent aux sites non liés sur la membrane, empêchant la liaison non spécifique des réactifs de détection.

Ensuite, ajoutez une solution contenant des anticorps primaires qui se lient à la protéine cible dans l’échantillon. Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Ensuite, ajoutez une solution d’anticorps secondaire. Ces molécules – marquées avec une enzyme peroxydase – se lient aux anticorps primaires liés aux protéines. Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Enfin, ajoutez une solution contenant un substrat chimiluminescent et du peroxyde d’hydrogène. En utilisant du peroxyde d’hydrogène, la peroxydase liée aux anticorps oxyde le substrat et émet de la lumière. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez l’intensité de luminescence de l’échantillon.

Générer une courbe de luminescence standard à l’aide d’une dilution en série avec des concentrations connues de la protéine cible. Tracez la valeur de luminescence mesurée de l’échantillon sur la courbe pour déterminer la concentration protéique cible.

Dans cette procédure, placez une boîte d’embout de pipette vide sous la plaque QDB pour éviter que le bas de la plaque ne touche la surface de la table. Chargez jusqu’à 2 microlitres de l’échantillon au centre de la membrane au bas d’une unité individuelle de la plaque QDB.

Ne laissez jamais le bas de la plaque QDB toucher une surface, pendant le chargement, et ne chargez pas trop pour un puits individuel. Vous n’avez pas plus de 4 microlitres par puits.

Ensuite, laissez la plaque QDB chargée pendant une heure à température ambiante, ou laissez la plaque chargée à 37 degrés Celsius pendant quinze minutes dans un espace bien ventilé. Pour bloquer la plaque, trempez la plaque QDB dans le tampon de transfert et secouez-la doucement pendant 10 secondes.

Après cela, rincez doucement la plaque QDB avec du TBST trois fois, puis lavez la plaque pendant cinq minutes dans du TBST en secouant constamment. Par la suite, bloquez la plaque QDB avec un tampon de blocage pendant une heure en secouant constamment. Maintenant, diluez l’anticorps primaire dans le tampon de blocage à une concentration choisie et ajoutez-en 100 microlitres à chaque puits individuel d’une plaque ordinaire de 96 puits.

Insérez la plaque QDB dans la plaque à 96 puits et incubez les plaques combinées soit pendant deux heures à température ambiante, soit toute la nuit à 4 degrés Celsius en secouant constamment. Après cela, rincez doucement la plaque avec du TBST trois fois, avant de la laver trois fois avec du TBST - chaque fois pendant cinq minutes en secouant constamment.

Ensuite, diluez l’anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration choisie et aliquote 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque à 96 puits. Ensuite, incubez la plaque QDB à l’intérieur de la plaque chargée de 96 puits pendant une heure à température ambiante sous agitation constante. Rincez doucement la plaque QDB trois fois avec du TBST, puis lavez la plaque trois fois, cinq minutes chacune avec du TBST en secouant constamment.

Pour la quantification, préparer le substrat ECL et l’aliquote dans une plaque de 96 puits à 100 microlitres par puits. Ensuite, insérez la plaque QDB à l’intérieur de la plaque à 96 puits pendant deux minutes en secouant constamment. Après cela, retirez la plaque QDB de la plaque à 96 puits et secouez brièvement pour éliminer l’excès de liquide. Ensuite, placez la plaque sur une plaque de microtitration blanche. Ensuite, allumez le lecteur de microplaques et sélectionnez la plaque avec couvercle sur l’interface utilisateur, avant de placer les plaques combinées à l’intérieur du lecteur de microplaques pour la quantification.