Transfert Western quantitatif pour estimer les niveaux d’expression des protéines

Le western blot quantitatif – une technique basée sur la normalisation des protéines totales – est utile pour quantifier les niveaux d’expression des protéines cibles.

Pour commencer, chargez du lysat tissulaire dans les puits d’un gel à gradient de polyacrylamide. Le lysat contient la protéine cible, ainsi que d’autres protéines cellulaires.

Faites fonctionner le gel à une tension appropriée pour la séparation électrophorétique des protéines de l’échantillon le long du gradient. Une fois terminé, placez le gel sur la membrane polymère d’une pile de transfert.

Appliquez un courant électrique pour transférer les protéines séparées sur la membrane. Ensuite, placez la membrane dans une coloration protéique totale fluorescente. Les molécules de colorant chargées dans la coloration se lient électrostatiquement à toutes les protéines de la membrane.

Ajoutez une solution de blocage. Les protéines de la solution se lient ainsi à la membrane. Empêcher la liaison non spécifique des réactifs de détection. Ajoutez un anticorps primaire se liant uniquement à la protéine cible. Ensuite, ajoutez un anticorps secondaire – marqué d’un fluorophore – qui se fixe à l’anticorps primaire.

Excissez l’échantillon avec un laser. Enregistrer la fluorescence émise par les molécules de colorant de la coloration protéique totale et les fluorophores liés aux anticorps à leurs longueurs d’onde correspondantes.

Pour calculer la valeur de charge protéique normalisée, divisez le signal protéique total de chaque voie par la valeur la plus élevée. Divisez le signal de la protéine cible par la valeur de charge normalisée correspondante pour déterminer l’expression relative de la protéine cible.

Pour l’électrophorèse, installez un gel prémoulé à gradient de 4 à 12 % de Bis-Tris dans le système de chambre d’électrophorèse sur gel, et chargez 3,5 microlitres d’un étalon de protéine dans le puits. Lors de l’utilisation d’un étalon interne pour la normalisation entre les membranes, chargez une quantité égale aux autres échantillons dans les trois premiers puits à côté de l’échelle protéique, et chargez 30 microgrammes de chaque échantillon dans les puits restants. Ensuite, faites passer les échantillons dans le gel d’empilement à 80 volts pendant 10 minutes, puis à 150 volts pendant 45 à 60 minutes supplémentaires.

À la fin de l’électrophorèse, pour assembler la pile de transfert, placez le gel protéique sur la pile inférieure contenant la membrane de difluorure de polyvinylidène suivie du papier filtre. Utilisez le rouleau buvard pour éliminer les bulles d’air et placez la pile supérieure sur le dessus du papier filtre, avant de rouler à nouveau la pile pour éliminer les bulles d’air.

Transférez l’ensemble de la pile dans le dispositif de transfert avec l’électrode sur le côté gauche de l’appareil et placez l’éponge de gel sur le dessus de la pile, de sorte que l’éponge soit alignée avec les contacts électriques correspondants sur l’appareil.

Après avoir fermé le couvercle, sélectionnez et démarrez le programme approprié. À la fin du programme, coupez la membrane à la taille du gel et lavez-la rapidement avec de l’eau distillée deux fois avant de poursuivre avec la coloration aux protéines totales.

Pour une coloration totale des protéines, roulez la membrane dans un tube de 50 millilitres avec le côté protéique vers l’intérieur et étiquetez la membrane avec 5 millilitres de solution de coloration protéique sur un rouleau pendant 5 minutes à température ambiante dans une hotte.

À la fin de l’incubation, lavez rapidement la membrane avec 5 millilitres de solution de lavage, en retournant brièvement le tube dans le rouleau entre les lavages, suivi d’un bref rinçage à l’eau ultra-pure. Ajoutez 3 millimètres de tampon de blocage à la membrane et remettez la membrane dans le rouleau pendant 30 minutes à température ambiante. Remplacez le tampon de blocage par l’anticorps principal d’intérêt à la concentration optimisée appropriée et incubez la membrane sur le rouleau pendant une nuit à 4 degrés Celsius.

Le lendemain, lavez la membrane 6 fois pendant 5 minutes avec 5 millilitres de PBS frais par lavage sur le rouleau à température ambiante. Après le dernier lavage, incubez la membrane avec la solution d’anticorps secondaire appropriée sur le rouleau pendant 1 heure à température ambiante, suivie de 3 lavages pendant 30 minutes par lavage. Après le dernier lavage, séchez la membrane et utilisez du papier d’aluminium pour protéger la membrane de la lumière.

Pour l’acquisition d’images, placez la membrane sur le scanner avec le côté protéique vers le bas et sélectionnez la zone de balayage dans le logiciel. Ensuite, acquérez des images dans les deux canaux et exportez-les vers un programme d’analyse d’images approprié.

Affichez le canal de 700 nanomètres pour afficher le résultat de la coloration totale des protéines, puis sélectionnez « Analyse » et dessinez un rectangle pour définir la zone d’intérêt pour la normalisation. Ensuite, copiez et collez la première zone rectangulaire sur chaque échantillon individuel pour vous assurer que la région définie est de la même taille pour toutes les voies analysées.

Pour quantifier la concentration en protéines dans chaque voie, copiez les résultats de la coloration totale des protéines et de la protéine d’intérêt dans un tableur et déterminez le signal de coloration totale des protéines le plus élevé. Divisez ensuite chaque valeur de signal de coloration protéique totale par cette valeur pour obtenir la valeur de charge protéique normalisée, et divisez la valeur de signal de 800 nanomètres de chaque échantillon individuel par sa valeur de protéine normalisée correspondante pour calculer le rapport d’expression relatif des protéines dans différents échantillons.