Western Blot unicellulaire pour déterminer l’hétérogénéité cellulaire

Les sites d’inflammation contiennent diverses cellules immunitaires, notamment des monocytes, des macrophages et des leucocytes.

Pour identifier une population cellulaire hétérogène par western blot unicellulaire, prenez une puce de transfert pré-hydratée, composée d’un gel de polyacrylamide photoactivable modelé en blocs. Chaque bloc comporte de nombreux micropuits. La mise en réseau en plusieurs blocs capture plusieurs cellules en parallèle.

Ajouter une suspension contenant une population cellulaire hétérogène. Les dimensions du puits permettent à des cellules individuelles de se déposer. Plongez la puce dans une chambre d’électrophorèse remplie d’un tampon approprié. Les molécules détergentes du tampon perturbent la membrane de la cellule, libérant le contenu cellulaire.

Appliquez un champ électrique. Les protéines libérées migrent à travers le gel, se séparant en bandes de taille distincte. Lavez la puce avec un tampon de lavage pour éliminer les molécules non spécifiquement liées, ne laissant que les protéines cellulaires, y compris les protéines marqueurs souhaitées.

Exposez le gel à la lumière UV, activant sa surface et immobilisant les protéines.

Ajoutez un cocktail d’anticorps primaires qui se lient spécifiquement aux protéines marqueurs distinctives de chaque type de cellule, formant des complexes protéine-anticorps primaires. Distribuez un mélange d’anticorps secondaires marqués fluorescents, qui se lient à leurs anticorps primaires respectifs, marquant la protéine marqueur spécifique de la cellule correspondante.

Placez la puce dans un scanner. Mesurer l’intensité de la fluorescence qui est proportionnelle au niveau d’expression du marqueur protéique correspondant spécifique à une seule cellule de la suspension de cellules de l’échantillon.

Pour une analyse par Western blot unicellulaire, ajoutez 1 millilitre de suspension unicellulaire diluée à une puce Western blot unicellulaire réhydratée au fond d’une boîte de Pétri de 10 centimètres. Après cinq à quinze minutes, examinez la puce sous microscopie à fond clair. Environ 15 % à 20 % des micropuits devraient être occupés par une seule cellule, et moins de 2 % des puits devraient contenir deux cellules ou plus.

Si la puce a été correctement chargée, inclinez la parabole à 45 degrés et lavez la puce trois fois avec un tampon de suspension pour retirer toutes les cellules non capturées. Après le dernier lavage, chargez soigneusement la puce dans la cellule d’électrophorèse d’un instrument Western unicellulaire, côté gel vers le haut, et recouvrez l’ensemble de la puce Western blot unicellulaire d’un tampon de lyse/fonctionnement. Lancez la lyse cellulaire et faites fonctionner l’instrument selon les paramètres d’expérience appropriés.

À la fin du cycle, rincez la puce avec deux lavages de 10 minutes avec un tampon de lavage frais par lavage à température ambiante. Après le deuxième lavage, ajoutez 80 microlitres de la solution d’anticorps primaire d’intérêt dans la chambre de sonde d’anticorps et abaissez la puce côté gel vers le bas de manière à ce que la solution d’anticorps traverse la puce.

Après deux heures à température ambiante, lavez la puce trois fois dans un tampon de lavage et une fois dans de l’eau sur un shaker. Incuber la puce avec un anticorps secondaire approprié pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez la puce trois fois avec un tampon de lavage et faites tourner la puce sur une toupie coulissante pour retirer tout tampon de lavage restant.

Pour démonter la puce Western blot à cellule unique, placez un support de tube de 50 millilitres dans un bain-marie à 60 degrés Celsius avec l’eau à seulement 1 centimètre au-dessus du support. Dans une hotte, ajoutez 40 millilitres de tampon de décapage et 320 microlitres de bêta-mercaptoéthanol dans une cartouche. Placez la puce dans une boîte de Pétri de 10 centimètres à l’intérieur de la cartouche et scellez la cartouche avec du parafilm.

Ensuite, placez la cartouche à l’intérieur du support de tube dans le bain-marie. Après 90 minutes, transférez soigneusement la puce dans une nouvelle boîte de Pétri et lavez brièvement la puce une fois avec un tampon de lavage avant d’ajouter 15 millilitres de tampon de lavage frais dans la boîte de Pétri pour un lavage de 15 minutes sur le shaker.