Dosage par transfert Western chimiluminescent pour le traitement des protéines

CD95 – un récepteur de mort – se lie à ses anticorps agonistiques, déclenchant l’assemblage d’un complexe de signalisation induisant la mort, ou DISC – un complexe multiprotéique qui recrute la procaspase 8. Au niveau du DISC, la procaspase 8 se dimérise et se transforme en divers produits de clivage intermédiaires et, enfin, en une forme active qui initie l’apoptose.

Pour analyser le traitement de la caspase-huit à l’aide d’un western blot chimiluminescent, prélever un lysat contenant des produits de clivage intermédiaires de la caspase 8 associés à DISC dans un tube. Complétez cela avec des anticorps anti-CD95 capturés par des billes de protéine A-agarose. Les anticorps anti-CD95 se lient au composant DISC, CD95, formant des complexes protéiques.

Chargez l’échantillon sur un gel de polyacrylamide SDS pour séparer les intermédiaires de la caspase 8 immunoprécipitée de différentes tailles en bandes distinctes. Placez le gel sur une membrane buvard et appliquez un courant électrique. Les intermédiaires de la caspase 8 sortent du gel sur la membrane de transfert.

Traitez la membrane avec une solution contenant des protéines bloquantes pour saturer les sites de liaison aux protéines, empêchant ainsi les liaisons non spécifiques.

Ajoutez une solution d’anticorps primaires, qui se lient aux produits de caspase-huit à un site spécifique.

Ajoutez des anticorps secondaires marqués d’enzymes qui se lient spécifiquement à la région Fc complémentaire de l’anticorps primaire pour former un complexe de produit de clivage caspase-huit-anticorps primaire-anticorps secondaire.

Ajoutez un substrat chimiluminescent qui réagit avec l’enzyme secondaire conjuguée aux anticorps et émet de la lumière. L’intensité de la lumière émise est en corrélation avec la quantité de produit de clivage caspase-huit.

Pour effectuer le western blot, ajoutez 20 microlitres de tampon de chargement 4X aux billes et chauffez à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Simultanément, chauffez les commandes de lysat à 95 degrés Celsius pendant 5 minutes. Chargez les lysats, les immunoprécipitants et un étalon protéique sur un gel SDS à 12,5 % et faites-le fonctionner avec une tension constante de 80 volts.

Une fois l’analyse du gel terminée, transférez les protéines du gel SDS vers une membrane de nitrocellulose. Une fois le transfert terminé, placez la membrane tamponnée dans une boîte et incubez-la pendant une heure dans une solution de blocage, sous une légère agitation. Ensuite, lavez la membrane trois fois pendant 5 minutes avec du PBST.

Pour détecter les protéines, ajoutez le premier anticorps primaire à la dilution indiquée dans la membrane et incubez-le pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec une légère agitation. Le lendemain, lavez la membrane avec trois lavages PBST de 5 minutes, puis incubez la membrane avec 20 millilitres d’anticorps secondaires en secouant doucement pendant 1 heure à température ambiante.

Lavez à nouveau la membrane trois fois avec du PBST. Après avoir jeté le dernier lavage PBST, ajoutez environ 1 millilitre de substrat de peroxyde de raifort à la membrane et détectez le signal chimioluminescent.