Dosage par transfert Western chimiluminescent pour le traitement des protéines

CD95 – un récepteur de mort – se lie à ses anticorps agonistiques, déclenchant l’assemblage d’un complexe de signalisation induisant la mort, ou DISC – un complexe multiprotéique qui recrute la procaspase 8. Au niveau du DISC, la procaspase 8 se dimérise et se transforme en divers produits de clivage intermédiaires et, enfin, en une forme active qui initie l’apoptose.

Pour analyser le traitement de la caspase-huit à l’aide d’un western blot chimiluminescent, prélever un lysat contenant des produits de clivage intermédiaires de la caspase 8 associés à DISC dans un tube. Complétez cela avec des anticorps anti-CD95 capturés par des billes de protéine A-agarose. Les anticorps anti-CD95 se lient au composant DISC, CD95, formant des complexes protéiques.

Chargez l’échantillon sur un gel de polyacrylamide SDS pour séparer les intermédiaires de la caspase 8 immunoprécipitée de différentes tailles en bandes distinctes. Placez le gel sur une membrane buvard et appliquez un courant électrique. Les intermédiaires de la caspase 8 sortent du gel sur la membrane de transfert.

Traitez la membrane avec une solution contenant des protéines bloquantes pour saturer les sites de liaison aux protéines,