Northern Blot pour détecter et quantifier des microARN spécifiques dans l’extrait d’ARN total de tissus végétaux

Les microARN, les miARN, sont de petits ARN monocaténaires, non codants. Les miARN s’incorporent dans un complexe multiprotéique et se lient davantage à des séquences d’ARNm cibles complémentaires pour réguler négativement l’expression des gènes.

Pour détecter des miARN spécifiques à partir de l’ARN total des tissus végétaux, ajoutez un colorant de chargement de gel contenant des colorants de suivi et du formamide - un agent dénaturant de l’ARN. Chauffer l’échantillon pour dénaturer l’ARN et empêcher la formation de structures secondaires avant l’électrophorèse.

Chargez l’échantillon et les marqueurs d’ARN standard dans les puits d’un gel de polyacrylamide dénaturant pré-assemblé. Exécutez l’électrophorèse, facilitant la séparation des fragments d’ARN en fonction de la taille.

Transférez le gel sur des papiers filtres pré-humides sur une cassette d’électrobuvard. Alignez une membrane buvard en nylon imbibée de tampon sur le gel. Ensuite, empilez les papiers-filtres pré-humides. Effectuez l’électrobuvardage.

Le courant électrique fait sortir l’ARN chargé négativement, y compris le miARN, du gel sur la surface de la membrane de nylon chargée positivement. Exposer la membrane à la lumière ultraviolette ; cela réticulent les ARN à la membrane, empêchant ainsi la perte d’ARN.

Incuber la membrane dans un tampon d’hybridation contenant des agents bloquants qui occupent les sites de liaison non spécifiques pour réduire le bruit de fond.

Ajoutez une sonde oligonucléotidique d’ARN radiomarquée complémentaire au miARN cible pour se lier spécifiquement à celui-ci. Lavez la membrane avec un tampon, en enlevant les sondes non liées.

Utiliser un système d’imagerie au phosphore pour détecter et quantifier les intensités des signaux d’hybridation radioactive. Le signal à haute résolution indique l’expression spécifique de miARN dans le tissu végétal.

Arrêtez la pré-course du gel.

Lavez soigneusement les puits avant de charger l’échantillon pour éliminer les dépôts d’urée à l’intérieur des puits. Chauffez les échantillons d’ARN remis en suspension à 98 degrés pendant 1 minute. Chargez les échantillons chauds dans les puits à l’aide d’embouts capillaires. Évitez d’introduire des bulles d’air.

Terminez le chargement de tous les échantillons et assemblez le couvercle. Faites fonctionner le gel à 80 volts pendant 3 heures, ou jusqu’à ce que le bleu de bromophénol coule complètement. Utilisez une membrane en nylon chargée positivement pour le transfert. Coupez-le aux dimensions de la plaque de verre. Étiquetez la membrane dans son coin supérieur droit. Placez délicatement la membrane à la surface de l’eau stérile Milli-Q. Assurez-vous de placer l’étiquette côté vers le bas, face à la surface de l’eau.

Prenez un plateau propre et préparez un sandwich au gel pour l’électrotransfert. Placez le côté gris de la cassette vers le bas. Versez 1X TBE légèrement au-dessus du niveau de la cassette. Pré-mouillez le tampon en fibre dans 1X TBE, et pressez-le pour éliminer les bulles d’air. Coupez deux morceaux de papier buvard de la taille d’un tampon en fibre.

Mouillez au préalable un morceau de papier buvard dans 1X TBE, et placez-le sur le tampon en fibre. Éliminez les bulles d’air en faisant rouler une pipette en plastique sur le papier. Mouillez au préalable un autre morceau de papier buvard dans un TBE 1X et posez-le sur la cassette. Retournez pour éliminer les bulles d’air. La configuration sandwich est maintenant prête pour l’électrotransfert.

Une fois l’électrophorèse terminée, arrêtez le cycle et retirez le couvercle de l’appareil. Retirez la cassette en marche de la configuration. Retirez les plaques de verre de la cassette en marche.

Retirez délicatement le gel de l’ensemble. Posez-le sur le papier buvard de manière à ce que le premier échantillon d’ARN chargé soit vers votre droite. Trempez doucement la membrane pré-trempée dans 1X TBE et placez-la sur le gel face à l’étiquette vers le bas. Ne laissez pas la membrane et le gel sécher. Roulez doucement pour éliminer les bulles d’air.

Trempez un morceau de papier buvard dans 1X TBE, et posez-le sur la membrane. Éliminez les bulles d’air. Placez un autre morceau de papier buvard et retirez les bulles d’air. Complétez le sandwich en posant le tampon en fibre sur l’ensemble. Fermez fermement la cassette.

Placez la cassette transblot dans le module. Remplissez le réservoir avec 1X TBE, pH 8,2, jusqu’au repère buvard. Fermez le couvercle de l’appareil et transférez à 10 volts pendant la nuit à 4 degrés ou dans une chambre froide. Gardez le réticulant UV prêt et réglez-le sur 1 200 juste avant la fin du transfert électrique.

Une fois le transfert terminé, retirez la cassette du module. Placez la membrane humide sur une feuille A4 en plaçant le côté marqué vers le haut. Réticulation de l’ARN à la membrane par irradiation avec une lumière UV de 254 nanomètres à 120 millijoules. Le transfert réticulé peut être stocké à 4 degrés ou utilisé pour l’hybridation.

Concevez une sonde qui est complètement complémentaire au petit ARN qui doit être détecté, et marquez la sonde à son extrémité 5 prime à l’aide de l’enzyme PNK, et combinez les composants comme indiqué. Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés pendant 30 minutes.

Après 30 minutes d’incubation, utilisez des colonnes G-25 pour séparer les sondes non étiquetées du mélange réactionnel. Pour un meilleur étiquetage de la sonde, préparez la colonne G-25 avant utilisation. Placez le blot, face de l’ARN vers le haut, à l’intérieur d’une bouteille d’hybridation. Mélangez vigoureusement le tampon d’hybridation avant utilisation. Ajoutez 10 ml de tampon d’hybridation, et placez la bouteille d’hybridation dans un four d’hybridation maintenu à 35 degrés avec rotation.

Effectuez une pré-hybridation pendant 20 à 30 minutes. Après la pré-hybridation, sortez la bouteille du four. Ajoutez doucement la sonde étiquetée dans le tampon d’hybridation. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air. Incuber la tache à l’intérieur du four à 35 degrés avec rotation pendant 12 heures.

Après l’hybridation, retirez le tampon d’hybridation de la bouteille. Effectuez un lavage rapide des taches à l’aide du tampon de lavage I. Cette étape est effectuée pour éliminer l’excès de solution d’hybridation des transferts. De plus, incubez les taches à 35 degrés pendant 30 minutes à l’aide du tampon de lavage I. Effectuez un autre lavage à l’aide du tampon II à 35 degrés pendant 30 minutes.

Après avoir lavé la tache, placez-la dans un couvercle d’hybridation, retirez l’excès de tampon et scellez-la. Placez-le dans une cassette et exposez-le à un écran d’imagerie au phosphore sans rayonnement pendant 12 heures. Détectez le signal d’hybridation à l’aide de l’imageur biomoléculaire Typhoon et analysez les résultats à l’aide du logiciel ImageJ.