Biodétection à effet de champ basée sur un biocapteur de graphène pour détecter les interactions protéine-protéine

Les interactions protéine-protéine, IPP, sont essentielles à la régulation de la plupart des processus biologiques.

Pour détecter les IPP à l’aide de la biodétection à effet de champ, commencez par une puce de transistor à effet de champ en graphène. La puce comprend une surface en graphène fonctionnalisée au carboxyle comme canal semi-conducteur entre la source et les électrodes de drainage.

Incuber la puce avec une solution fraîche de carbodiimide et de N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS, dans un tampon zwitterionique. Ce tampon crée un pH approprié, permettant au carbodiimide et au sulfo-NHS d’activer les groupes carboxyle fonctionnalisés de la puce, formant des esters réactifs aux amines.

Ajouter la solution protéique cible. Les amines primaires réagissent avec les esters réactifs aux amines, immobilisant les protéines sur la puce par la formation de liaisons amides. Ajouter une solution d’extinction contenant des amines pour bloquer les esters amines réactifs non liés, empêchant ainsi la liaison non spécifique.

Insérez la puce dans le lecteur électronique et calibrez-la avec un tampon. Le lecteur applique une tension constante entre les électrodes. Le flux de courant électrique résultant entre les électrodes à l’état non lié à l’analyte est mesuré.

Ajouter la concentration d’analyte la plus faible. L’interaction entre les protéines de l’analyte et les cibles immobilisées sur la puce modifie la distribution de charge locale de la surface du graphène, enregistrée comme réponse I – la variation du flux de courant entre les électrodes.

Après l’enregistrement, laver avec un tampon pour dissocier les analytes liés. Répétez l’analyse avec des concentrations croissantes d’analytes.

Une augmentation progressive de la réponse I avec l’augmentation des concentrations d’analyte indique de forts IPP entre la cible et l’analyte.

Commencez par mélanger des volumes égaux de solution EDC et sulfo-NHS en pipetant vers le haut et vers le bas. Placez les puces de biocapteur fournies par l’entreprise dans une boîte de Pétri en verre avec un couvercle adapté. Il est suggéré d’effectuer toutes les étapes de fonctionnalisation impliquées dans l’activation de la puce dans la boîte de Pétri. Appliquez 50 microlitres de tampon MES à 1 molaire sur la puce du biocapteur. Incuber 1 minute à température ambiante.

Ensuite, aspirez le tampon et appliquez immédiatement 50 microlitres de solution EDC/sulfo-NHS sur la puce du capteur. Couvrez la boîte de Pétri et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Aspirez la solution EDC/sulfo-NHS de la puce et appliquez 50 microlitres de tampon MES à 1 molaire.

Aspirez le tampon MES et rincez la puce deux fois avec 50 microlitres de 1x PBS. Aspirez le PBS de la puce et ajoutez la molécule cible Hsp90. Couvrez la boîte de Pétri en verre et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez la solution contenant la molécule cible, et rincez trois fois avec 50 microlitres de 1x PBS.

Aspirez la solution 1x PBS de la puce et ajoutez 50 microlitres de la solution Quench 1. Couvrez la boîte de Pétri en verre et laissez incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Aspirez la solution Quench 1 de la puce et ajoutez 50 microlitres de solution Quench 2. Couvrez la boîte de Pétri en verre et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Après cela, aspirez la solution Quench 2 de la puce et rincez la puce cinq fois à l’aide de 50 microlitres de 1X PBS en laissant la dernière gouttelette de PBS sur le capteur.

Préparer la série de dilution de l’analyte pour Cdc37 dans la plage de concentration souhaitée. Concevez l’expérience de manière à ce qu’elle comprenne au moins huit concentrations d’analytes différentes afin d’obtenir une constante de dissociation fiable ou une valeur K_d, et préparez ces différentes dilutions dans le même tampon utilisé pour l’étalonnage et la protéine cible.

Placez soigneusement la puce dans l’instrument. Assurez-vous que le logiciel est allumé et que le voyant LED devient vert. Ensuite, appuyez sur le module « Run Experiment » du logiciel automatisé et choisissez « 10 points avec régénération » ou tout autre protocole souhaité. Remplissez les détails, tels que le nom de l’opérateur, le nom de l’expérience, la date, le tampon de régénération, la cible immobilisée et l’analyte en solution. Appuyez sur le bouton « Commencer l’expérience » affiché sur le logiciel et suivez les instructions affichées par le logiciel automatisé.

Pour effectuer l’étalonnage de l’instrument, aspirez la solution PBS restante de la puce et appliquez 50 microlitres de tampon d’étalonnage. Appuyez sur le bouton « Continuer » et attendez cinq minutes jusqu’à ce que l’étape d’étalonnage soit terminée. Le logiciel affiche le point final déterminé pour l’étape d’étalonnage avec une alarme d’avertissement pour le suivi.

Ensuite, effectuez une association d’analyte en aspirant le tampon d’étalonnage de la puce et en appliquant 50 microlitres de la concentration d’analyte la plus faible. Appuyez sur le bouton « Continuer » et attendez cinq minutes jusqu’à ce que l’étape d’association soit terminée. Le logiciel affiche le point final de l’étape d’association avec une alarme d’avertissement pour continuer.

Pour effectuer une dissociation de l’analyte, aspirez la solution d’analyte de la puce et appliquez 50 microlitres de tampon de dissociation. Appuyez sur le bouton « Continuer ». Après la durée de l’étape de dissociation, le logiciel affiche le point final de l’étape de dissociation avec une alarme d’avertissement.

Ensuite, effectuez la régénération de la puce en aspirant la solution de dissociation de la puce et en appliquant 50 microlitres de tampon de régénération. Ensuite, appuyez sur le bouton « Continuer ». L’étape de régénération prend généralement environ 30 secondes. Ensuite, le logiciel affiche le point final de l’étape de régénération avec l’alarme d’avertissement à suivre.

Enfin, pour laver la puce, aspirez la solution de régénération de la copeau et appliquez 50 microlitres de tampon de lavage. Aspirez la solution de la puce et répétez l’opération cinq fois. Laissez la dernière goutte du tampon de lavage sur la puce. Ensuite, appuyez sur le bouton « Continuer » et attendez 30 secondes jusqu’à ce que la durée de l’étape de lavage soit terminée sur l’écran du logiciel.

Répétez les étapes pour chaque concentration d’analyte utilisée. Les cinq étapes de l’étalonnage, de l’association de l’analyte, de la dissociation, de la régénération et du lavage cinq fois constituent un cycle.