Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 4:26 min • July 8th, 2025
Pour étudier des interactions protéine-protéine spécifiques dans des bactéries vivantes à l’aide de la microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence, FLIM, combinée au transfert d’énergie de résonance de Förster, FRET, commencez par une suspension bactérienne recombinante. Les bactéries expriment des protéines cytoplasmiques spécifiques impliquées dans les voies métaboliques, marquées avec des protéines fluorescentes donneuses et accepteuses adaptées à la FRET.
Repérez la suspension bactérienne sur un tampon d’agarose, qui immobilise les bactéries sur une lame de microscope. Placez une lamelle sur la glissière et scellez-la.
Positionnez la lame sur la platine d’un microscope à balayage inversé à excitation biphotonique pour la microscopie FLIM-FRET. Utilisez une lampe à fluorescence pour sélectionner et scanner une région d’intérêt sur la monocouche bactérienne.
L’interaction entre les protéines cytoplasmiques exprimées rapproche les protéines fluorescentes donneuses et accepteuses dans une orientation appropriée. Lors de l’éclairage laser avec une longueur d’onde appropriée, la protéine fluorescente du donneur est excitée.
La proximité des protéines fluorescentes déclenche le FRET, entraînant un transfert d’énergie non radiatif des protéines fluorescentes donneuses à accepteuses, qui sont excitées et finissent par revenir à l’état fondamental, émettant une fluorescence.
Le transfert d’énergie non radiative réduit le temps nécessaire à la protéine fluorescente du donneur excité pour revenir à son état fondamental, la durée de vie de la fluorescence du donneur, mesurée par FLIM. La diminution de la durée de vie moyenne de fluorescence de la protéine fluorescente donneuse due à la FRET confirme l’interaction protéine-protéine dans les bactéries.
Placez une lame de verre de microscope sur une surface horizontale plane et disposez deux lames de verre surmontées de deux couches de ruban adhésif autour d’elle. Pipetez une gouttelette de 70 microlitres d’agarose fondu à 1 % sur la lame de verre et placez une quatrième lame sur le dessus pour aplatir la gouttelette d’agarose. Appuyez doucement pendant environ une minute.
Retirez la lame supérieure et déposez environ trois microlitres de bactéries à trois ou quatre endroits à différents endroits sur le tampon d’agarose. Couvrez le tampon d’agarose avec une lamelle en verre de microscopie et fixez-le avec de la paraffine fondue pour le sceller sur la lame de verre, en commençant par les quatre coins.
Placez la lame de microscopie sur la platine, avec la lamelle tournée vers l’objectif. Tournez la tourelle du cube de filtre pour sélectionner le cube eGFP et ouvrez l’obturateur de la lampe de fluorescence. Ensuite, envoyez la lumière de fluorescence vers l’oculaire du microscope. Focalisez l’objectif sur la bactérie à l’aide du bouton du microscope.
Sélectionnez une région d’intérêt dans l’échantillon à l’aide du joystick qui contrôle la platine motorisée. Renvoyez le chemin d’émission de fluorescence vers le détecteur, puis retournez la tourelle du cube de filtre pour sélectionner le cube dichroïque pour le laser de 930 nanomètres, et réglez la puissance du laser sur 20 milliwatts. Réglez la taille de la région d’intérêt à 30 micromètres, ce qui ajuste la tension de fonctionnement des galvo-miroirs et définit la plage de leurs mouvements.
Allumez le détecteur et commencez à scanner l’échantillon. Choisissez le champ de vision pour l’imagerie, en déplaçant enfin la platine depuis l’interface de l’ordinateur. Cela peut être fait sur la configuration en déplaçant la croix sur l’image dans le logiciel de contrôle du microscope qui définira le nouveau centre de l’image, et en appuyant sur « Déplacer la platine ».
Un bon champ de vision pour l’acquisition doit contenir 10 à 30 bactéries immobiles, toutes nettes. Si vous souhaitez extraire les données FLIM-FRET de cellules uniques, assurez-vous que les bactéries sont bien individualisées.