Imagerie FLIM-FRET pour la caractérisation des interactions protéine-protéine chez les bactéries vivantes
JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:26 min • July 8th, 2025
Pour étudier des interactions protéine-protéine spécifiques dans des bactéries vivantes à l’aide de la microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence, FLIM, combinée au transfert d’énergie de résonance de Förster, FRET, commencez par une suspension bactérienne recombinante. Les bactéries expriment des protéines cytoplasmiques spécifiques impliquées dans les voies métaboliques, marquées avec des protéines fluorescentes donneuses et accepteuses adaptées à la FRET.
Repérez la suspension bactérienne sur un tampon d’agarose, qui immobilise les bactéries sur une lame de microscope. Placez une lamelle sur la glissière et scellez-la.
Positionnez la lame sur la platine d’un microscope à balayage inversé à excitation biphotonique pour la microscopie FLIM-FRET. Utilisez une lampe à fluorescence pour sélectionner et scanner une région d’intérêt sur la monocouche bactérienne.
L’interaction entre les protéines cytoplasmiques exprimées rapproche les protéines fluorescentes donneuses et accepteuses dans une orientation appropriée. Lors de l’éclairage laser avec une longueur d’onde appropriée, la protéine fluorescente du donneur est excitée.
La proximité des protéines fluorescentes déclenche le FRET, entraînant un transfert d’énergie non radiatif des protéines fluorescentes donneuses à accepteuses, qui sont excitées et finissent par revenir à l’état fondamental, émettant une fluorescence.
Le transfert d’énergie non radiative réduit le temps nécessaire à la protéine fluorescente du donneur excité pour revenir à son état fondamental, la durée de vie de la fluorescence du donneur, mesurée par FLIM. La diminution de la durée de vie moyenne de fluorescence de la protéine fluorescente donneuse due à la FRET confirme l’interaction protéine-protéine dans les bactéries.
Placez une lame de verre de microscope sur une surface horizontale plane et disposez deux lames de verre surmontées de deux couches de ruban adhésif autour d’elle. Pipetez une gouttelette de 70 microlitres d’agarose fondu à 1 % sur la lame de verre et placez une quatrième lame sur le dessus pour aplatir la gouttelette d’agarose. Appuyez doucement pendant environ une minute.
Retirez la lame supérieure et déposez environ trois microlitres de bactéries à trois ou quatre endroits à différents endroits sur le tampon d’agarose. Couvrez le tampon d’agarose avec une lamelle en verre de microscopie et fixez-le avec de la paraffine fondue pour le sceller sur la lame de verre, en commençant par les quatre coins.
Placez la lame de microscopie sur la platine, avec la lamelle tournée vers l’objectif. Tournez la tourelle du cube de filtre pour sélectionner le cube eGFP et ouvrez l’obturateur de la lampe de fluorescence. Ensuite, envoyez la lumière de fluorescence vers l’oculaire du microscope. Focalisez l’objectif sur la bactérie à l’aide du bouton du microscope.
Sélectionnez une région d’intérêt dans l’échantillon à l’aide du joystick qui contrôle la platine motorisée. Renvoyez le chemin d’émission de fluorescence vers le détecteur, puis retournez la tourelle du cube de filtre pour sélectionner le cube dichroïque pour le laser de 930 nanomètres, et réglez la puissance du laser sur 20 milliwatts. Réglez la taille de la région d’intérêt à 30 micromètres, ce qui ajuste la tension de fonctionnement des galvo-miroirs et définit la plage de leurs mouvements.
Allumez le détecteur et commencez à scanner l’échantillon. Choisissez le champ de vision pour l’imagerie, en déplaçant enfin la platine depuis l’interface de l’ordinateur. Cela peut être fait sur la configuration en déplaçant la croix sur l’image dans le logiciel de contrôle du microscope qui définira le nouveau centre de l’image, et en appuyant sur « Déplacer la platine ».
Un bon champ de vision pour l’acquisition doit contenir 10 à 30 bactéries immobiles, toutes nettes. Si vous souhaitez extraire les données FLIM-FRET de cellules uniques, assurez-vous que les bactéries sont bien individualisées.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant d'étudier les interactions entre protéines chez des bactéries vivantes en utilisant la microscopie d'imagerie de durée de vie de fluorescence (FLIM) combinée au transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET). L'approche consiste à immobiliser des bactéries exprimant des protéines marquées par fluorescence sur une lame de microscope et à analyser leurs interactions à travers les variations de la durée de vie de fluorescence.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biophysique
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les interactions entre protéines sont cruciales pour comprendre les processus cellulaires.
- La technique FLIM-FRET est puissante pour étudier ces interactions dans des cellules vivantes.
- Les protéines fluorescentes servent de donneurs et d'accepteurs dans les expériences de FRET.
- L'imagerie en temps réel permet l'observation directe des interactions.
Objectif de l'étude
- Étudier des interactions protéiques spécifiques dans les cellules bactériennes.
- Utiliser la microscopie de durée de vie de fluorescence (FLIM-FRET) pour mesurer les variations de la durée de vie de fluorescence.
- Approfondir la compréhension des voies métaboliques grâce aux interactions protéiques.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une suspension bactérienne recombinante exprimant des protéines fluorescentes.
- Immobilisation des bactéries sur un coussin d'agarose pour la microscopie.
- Utilisation d'un microscope balayant inversé à excitation à deux photons pour l'imagerie.
- Mesure de la durée de vie de la fluorescence pour évaluer l'efficacité de la FRET.
Résultats principaux
- Immobilisation réussie de bactéries pour l'imagerie.
- Démonstration de la FRET indiquant des interactions protéine-protéine.
- Mesure quantitative des changements de durée de vie de la fluorescence du donneur.
- Validation de la méthode pour l'étude des interactions métaboliques chez des bactéries vivantes.
Conclusions
- La FLIM-FRET est efficace pour l'étude des interactions protéiques chez des bactéries vivantes.
- La méthode fournit des informations sur les voies métaboliques et la dynamique des protéines.
- Cette approche peut être appliquée à divers domaines de recherche biologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La FLIM-FRET permet une évaluation quantitative des interactions entre protéines dans des systèmes bactériens vivants, offrant des éclairages mécanistiques sur la régulation des voies métaboliques. Cette approche soutient la validation des cibles en confirmant les associations fonctionnelles entre protéines dans un contexte cellulaire natif, réduisant ainsi l'ambiguïté lors des tests d'hypothèses en phase précoce. La technique procure une confiance prédictive pour l'atténuation des risques liés aux cibles impliquées dans le métabolisme bactérien, orientant ainsi leur priorisation dans les programmes de découverte d'antimicrobiens.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Mesure les changements de durée de vie de la fluorescence du donneur afin de confirmer les interactions entre protéines chez des bactéries vivantes exprimant des protéines cytoplasmiques marquées.
- Valeur opérationnelle : Utilise des suspensions bactériennes recombinantes immobilisées sur des lames d'agarose pour une préparation et un examen d'échantillons reproductibles.
- Valeur scientifique : Quantifie l'efficacité de la transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) au moyen de la réduction de la durée de vie de fluorescence, fournissant des données objectives pour l'évaluation de l'engagement de la cible.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Permet la préparation de systèmes bactériens validés exprimant l'accepteur mCherry et le donneur eGFP pour un criblage d'interactions reproductible.
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation des tests grâce à une excitation laser contrôlée à 930 nm et un balayage défini de la région d'intérêt (30 μm) pour une acquisition de données cohérente.
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives de durée de vie de fluorescence permettant de comparer l'intensité des interactions selon les conditions ou les mutants.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre les interactions protéiques observées et la fonction des voies métaboliques, contribuant ainsi à l'atténuation mécanistique des risques associés aux cibles dans les systèmes bactériens.
- Valeur opérationnelle : Assure une continuité entre la découverte et l'évaluation préclinique en permettant l'imagerie en cellules vivantes d'interactions dynamiques dans des conditions proches des conditions physiologiques.
- Valeur scientifique : Facilite la prise de décisions d'avancement ajustées au risque en confirmant l'engagement de la cible dans un contexte de cellules vivantes pertinent pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La microscopie de durée de vie de fluorescence par transfert d'énergie de résonance (FLIM-FRET) s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur des cibles à l'identification de composés candidats, en particulier pour les programmes antimicrobiens ciblant les voies métaboliques bactériennes.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en mesurant les changements de durée de vie de la fluorescence qui confirment des interactions spécifiques entre protéines dans des bactéries vivantes.
- Écrantage : Permet la préparation des tests grâce à l'immobilisation standardisée de monocouches bactériennes et à la sélection de régions d'intérêt pour une imagerie reproductible.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de la durée de vie de la fluorescence qui permettent aux équipes de comparer l'efficacité des interactions selon différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure le lien entre la validation de cibles et la continuité préclinique en démontrant des interactions fonctionnelles entre protéines dans des systèmes bactériens vivants.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité d'imagerie réutilisable pour l'analyse de multiples paires de protéines dans des modèles bactériens au sein de divers projets de découverte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la validation des cibles en quantifiant les interactions protéine-protéine par des variations de durée de vie de la fluorescence.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à une immobilisation normalisée sur coussin d'agarose et à des paramètres de stimulation à deux photons contrôlés.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données objectives d'efficacité de la FRET qui réduisent l'ambiguïté mécanistique dans le choix des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles selon la force d'interaction confirmée dans des systèmes bactériens vivants.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence, en acquisition de durée de vie de fluorescence (FLIM) et en sélection de paires FRET pour le marquage de protéines bactériennes.
- Dépend d'un microscope inversé à balayage avec excitation à deux photons, doté d'un laser accordable (930 nm) et d'une capacité de détection de la durée de vie de fluorescence.
- Implique une standardisation des protocoles d'immobilisation des bactéries et de la taille des régions d'intérêt (30 μm) entre les utilisateurs et les laboratoires.
- Implique des adaptations selon les souches bactériennes, les conditions de croissance et les niveaux d'expression des protéines fluorescentes.
- Comprend des limites pratiques telles que les risques de photodégradation et la nécessité d'utiliser des bactéries immobiles (10 à 30 cellules par champ) pour une extraction fiable des données.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026