Essai d’agrégation cellulaire pour détecter les interactions trans entre les molécules d’adhésion cellulaire

Dans le système nerveux, les interactions transcellulaires – interactions entre des molécules d’adhésion cellulaires synaptiques spécifiques, des protéines transmembranaires, sur les neurones présynaptiques et postsynaptiques – forment un complexe au niveau des synapses, médiant la signalisation transsynaptique.

Pour détecter les interactions transcellulaires entre les molécules d’adhésion cellulaire synaptique exprimées sur des cellules rénales embryonnaires humaines via un test d’agrégation cellulaire, commencez par des suspensions de cellules transfectées.

Une population cellulaire transfectée exprime la molécule d’adhésion cellulaire présynaptique souhaitée et la protéine fluorescente verte ; l’autre exprime la molécule d’adhésion cellulaire postsynaptique spécifique et la protéine fluorescente rouge. Deux populations cellulaires exprimant des protéines fluorescentes vertes et rouges sont également obtenues.

Centrifugez les cellules. Remettre les cellules en suspension dans un milieu approprié complété par des ions calcium. Mélangez les cellules transfectées des deux populations de manière égale dans un tube. Répétez l’opération pour les autres populations cellulaires.

Au cours de l’incubation, les ions calcium se lient à un site spécifique de la protéine présynaptique exprimée dans une population cellulaire. Cela augmente l’interaction de la protéine présynaptique avec le ligand postsynaptique de l’autre population cellulaire, facilitant la liaison, médiant l’adhésion cellulaire hétérophile entre ces cellules et conduisant à l’agrégation cellulaire.

Sous un microscope à fluorescence, imagez les cellules à l’aide de canaux appropriés, en visualisant la fluorescence verte et rouge des cellules. Traitez les images.

Aucune agrégation n’est observée dans les populations cellulaires exprimant uniquement les protéines fluorescentes. L’agrégation cellulaire est visualisée en jaune en raison du chevauchement entre les cellules fluorescentes vertes et rouges exprimant les molécules d’adhésion des cellules synaptiques, suggérant des interactions transcellulaires entre les molécules.

48 heures après la transfection des cellules HEK293T, récoltez les cellules de la plaque à 6 puits pour l’agrégation. Tout d’abord, lavez bien chacun deux fois avec du PBS. Ensuite, pour dissocier doucement les cellules, ajoutez 1 millilitre d’EDTA de 10 millimolaires dans chaque puits. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius.

Après cinq minutes d’incubation, tapotez doucement la plaque pour détacher les cellules et récoltez chaque puits dans un tube conique séparé de 15 millilitres. Centrifugez les tubes à 500 x g à température ambiante pendant 5 minutes.

Pendant que les cellules sont en granulation, préparez six tubes d’incubation en étiquetant le dessus des tubes de microcentrifugation avec les conditions expérimentales. Chaque permutation de GFP et de mCherry doit être utilisée.

Retirez les surnageants des tubes coniques de 15 millilitres et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de fluide. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules dans chaque tube conique. Ensuite, aliquote 200 000 cellules de chaque condition dans le tube d’incubation approprié pour un mélange individuel dans un volume total de 500 microlitres. Placez les tubes d’incubation dans un rotateur de tube lent à température ambiante.

Pour évaluer l’agrégation, au départ, et à nouveau après 60 minutes, pipetez 40 microlitres du tube d’incubation sur une lame de microscope chargée. L’acquisition de la ligne de base doit être effectuée le plus rapidement possible après l’ajout des cellules dans le tube de microcentrifugation.

Imagez la lame sous fluorescence dans les canaux vert et rouge. Pour chaque diapositive, capturez des images de trois champs de vision différents dans un plan focal.