Essai de ligature de proximité pour étudier les interactions protéine-protéine in situ

Commencez le test de ligature de proximité en prenant des nématodes disséqués et en les fixant sur une lame avec leurs cellules germinales exposées. Ces cellules présentent des niveaux élevés de complexes ribonucléoprotéiques contenant des protéines de liaison à l’ARN, les RBP, associées à leurs protéines partenaires.

Superposez la lame avec deux anticorps primaires qui reconnaissent deux protéines cibles spécifiques : la RBP et sa protéine partenaire. Complétez la lame avec deux types d’anticorps secondaires spécifiques à leurs anticorps primaires respectifs.

Chaque anticorps secondaire est conjugué à des sondes PLA - des brins d’ADN avec des séquences complémentaires. Les anticorps secondaires se lient aux anticorps primaires pré-attachés, rapprochant les deux sondes PLA.

Appliquez le tampon de ligature contenant des oligonucléotides de connexion – qui s’hybrident avec les sondes PLA – et l’enzyme ligase scelle l’espace, générant de l’ADN circulaire. Incuber la lame avec une solution d’amplification contenant de l’ADN polymérase, des dNTP et des sondes de détection fixées à un fluorophore rouge.

En utilisant l’ADN circularisé comme matrice, la polymérase initie une amplification en cercle roulant, générant de nombreuses copies de l’ADN matrice connectées les unes aux autres. L’ADN amplifié reste attaché à la sonde PLA, ce qui permet la localisation de l’interaction protéine-protéine.

Les sondes du détecteur, portant de courts oligonucléotides simple brin, interagissent avec les régions complémentaires de l’ADN amplifié, formant des duplex et transmettant des signaux de fluorescence aux complexes protéiques. Imagez la lame au microscope à fluorescence.

Observez les taches rouges distinctes à l’intérieur de la cellule, indiquant des interactions protéine-protéine réussies.

Utilisez le diluant d’anticorps pour diluer les anticorps primaires. Appliquez 40 microlitres de la solution d’anticorps primaires diluée par espace de 14 x 14 millimètres sur les lames. Placez les lames dans une chambre humide et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius.

Le matin, lavez les lames deux fois pendant 5 minutes chacune avec 50 millilitres de 1x tampon de lavage A à température ambiante dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un agitateur orbital réglé sur 60 tr/min. Placez les lames sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’écouler de la diapositive et essuyez doucement les bords.

Préparez une solution de 40 microlitres contenant des sondes plus et moins. Ajoutez la solution à chaque espace de 14 x 14 millimètres. Incuber les lames dans une chambre humide pendant 1 heure à 37 degrés Celsius. Lavez les lames deux fois pendant 5 minutes chacune avec 50 millilitres de 1x tampon de lavage A à température ambiante dans un bocal Coplin.

Réglez le pot Coplin sur un agitateur orbital réglé sur 60 tr/min. Diluez le tampon de ligature 1 à 5 avec de l’eau ultra-pure. Utilisez ce tampon pour diluer la ligase 1 à 40 afin de préparer un stock de travail de solution de ligature. Placez la diapositive sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’écouler sur les côtés et essuyez doucement les bords.

Ajoutez 40 microlitres de solution de ligature à chaque espace de 14 x 14 millimètres. Incuber les lames dans une chambre humide pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir lavé et séché les lames comme décrit précédemment, ajoutez 40 microlitres de solution d’amplification fraîchement préparée et protégée de la lumière dans chaque espace de 14 x 14 millimètres.

Incuber les lames dans la chambre sombre et humide pendant 1 heure et 40 minutes à 37 degrés Celsius. Lavez les lames deux fois pendant 10 minutes chacune avec 50 millilitres de 1x tampon de lavage B, et lavez les lames une fois pendant 1 minute avec 50 millilitres de 0,01x tampon de lavage B.

Après avoir dessiné le périmètre revêtu d’époxy de la lame, ajoutez 10 microlitres de milieu de montage à chaque échantillon et posez doucement une lamelle sur le dessus, permettant au milieu de montage de s’étaler. Peignez le bord de la lamelle avec du vernis à ongles pour sceller la lamelle et glissez-la. Évitez de déplacer la lamelle. Laissez le vernis durcir pendant au moins 20 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.