Essai de ligature de proximité pour étudier les interactions protéine-protéine in situ

Commencez le test de ligature de proximité en prenant des nématodes disséqués et en les fixant sur une lame avec leurs cellules germinales exposées. Ces cellules présentent des niveaux élevés de complexes ribonucléoprotéiques contenant des protéines de liaison à l’ARN, les RBP, associées à leurs protéines partenaires.

Superposez la lame avec deux anticorps primaires qui reconnaissent deux protéines cibles spécifiques : la RBP et sa protéine partenaire. Complétez la lame avec deux types d’anticorps secondaires spécifiques à leurs anticorps primaires respectifs.

Chaque anticorps secondaire est conjugué à des sondes PLA - des brins d’ADN avec des séquences complémentaires. Les anticorps secondaires se lient aux anticorps primaires pré-attachés, rapprochant les deux sondes PLA.

Appliquez le tampon de ligature contenant des oligonucléotides de connexion – qui s’hybrident avec les sondes PLA – et l’enzyme ligase scelle l’espace, générant de l’ADN circulaire. Incuber la lame avec une solution d’amplification contenant de l’ADN polymérase, des dNTP et des sondes de détection fixées à un fluorophore rouge.

En utilisant l’ADN circularisé comme matrice, la polymérase initie une amplification