Digestion de protéines sur membrane pour préparer des protéines co-immunoprécipitées pour des études d’interaction

Pour effectuer une digestion sur membrane, prenez une solution de complexes protéiques co-immunoprécipités, chacun contenant une protéine cible recombinante marquée à la GFP associée à sa protéine partenaire.

Transférez les protéines dans un tube contenant une membrane en polyfluorure de vinylidène pré-humide, en PVDF, et incubez. La surface hydrophile de la membrane PVDF aide à transférer les protéines sur la membrane.

Transférez la membrane contenant des protéines dans un tube frais. Ajouter un tampon contenant un agent réducteur pour réduire les liaisons disulfure entre les résidus de cystéine, conduisant à la dénaturation des protéines individuelles dans les complexes sans perturber leur interaction.

Remplacez cette solution par un réactif alkylant, qui alkyle le groupe sulfhydryle des deux protéines dans les complexes et empêche la reformation des liaisons disulfure. Lavez la membrane pour éliminer tout excès de réactif.

Traitez la membrane avec un tampon contenant de la trypsine - une enzyme protéolytique. La trypsine clive la protéine cible marquée à la GFP et sa protéine partenaire à la terminaison carboxyle des résidus d’arginine et de lysine, libérant les peptides plus petits dans le surnageant. Transférez le surnageant dans un tube frais.

Laver la membrane avec une solution acide, en dissociant tous les peptides liés de la membrane, assurant ainsi une extraction complète. Tirez les fractions contenant des peptides dans un seul tube. Dessécher par séchage sous vide.

Remettre en suspension les résidus dans une faible concentration d’acide formique, en dissolvant les peptides, qui sont prêts pour l’identification de l’interaction protéine-protéine.

Pour préparer la membrane, coupez les membranes PVDF en morceaux de 3 millimètres sur 3 millimètres à l’aide de ciseaux chirurgicaux nettoyés immédiatement avant utilisation. Placez les morceaux de membrane sur du papier d’aluminium et ajoutez 2 à 5 microlitres d’éthanol à chaque morceau. Avant que les membranes ne soient complètement sèches, ajoutez 2 à 5 microlitres d’éluant protéique à chaque morceau et faites-les sécher à l’air libre jusqu’à ce que la surface de la membrane devienne mate.

Ensuite, transférez les membranes dans des tubes de 1,5 millilitre et stockez-les à 4 degrés Celsius. En cas d’utilisation immédiate, ajoutez 2 à 30 microlitres d’éthanol, ce qui les rendra hydrophiles. Retirez l’éthanol à l’aide d’une pipette. Mais avant que les membranes ne sèchent, ajoutez complètement 200 microlitres de solution réactionnelle à base de DTT dans chaque tube et incubez-les à 56 degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation, remplacez la solution réactionnelle par 300 microlitres de solution d’iodoacétamide et incubez dans l’obscurité pendant 45 minutes. Ensuite, lavez les membranes deux fois avec de l’eau distillée et une fois avec de l’acétonitrile à 2 % en tourbillonnant pendant au moins 10 secondes.

Travailler avec du dithiothréitol et de l’acétonitrile peut être extrêmement dangereux. Un masque, des lunettes et des gants doivent toujours être portés lors de la procédure de digestion sur membrane.

Préparez la trypsine selon les instructions du manuscrit et ajoutez 100 microlitres de solution réactionnelle de trypsine dans chaque membrane. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius pour la digestion.

Le lendemain, transférez la solution réactionnelle dans un tube propre de 1,5 millilitre et ajoutez 100 microlitres de solutions lavées à la membrane. Incuber la membrane à 60 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, récupérez la solution lavée et mélangez-la avec la solution réactionnelle. Ajoutez encore 100 microlitres de solution lavée à la membrane et sonicez-la pendant 10 minutes. Ensuite, récupérez la solution lavée et mélangez-la avec la solution réactionnelle. Couvrez le tube à essai avec un morceau de film de laboratoire et faites de petits trous dans le film avec une aiguille.

Séchez la solution à l’aide d’un concentrateur sous vide et dissolvez le résidu dans 10 microlitres d’acide formique à 0,2 %. Centrifugez le tube à 12 000 x g pendant trois minutes et transférez le surnageant dans un tube d’échantillon.

Analysez l’échantillon à l’aide d’un spectromètre de masse relié à un système HPLC nano-LC.