Digestion de protéines sur membrane pour préparer des protéines co-immunoprécipitées pour des études d’interaction

Pour effectuer une digestion sur membrane, prenez une solution de complexes protéiques co-immunoprécipités, chacun contenant une protéine cible recombinante marquée à la GFP associée à sa protéine partenaire.

Transférez les protéines dans un tube contenant une membrane en polyfluorure de vinylidène pré-humide, en PVDF, et incubez. La surface hydrophile de la membrane PVDF aide à transférer les protéines sur la membrane.

Transférez la membrane contenant des protéines dans un tube frais. Ajouter un tampon contenant un agent réducteur pour réduire les liaisons disulfure entre les résidus de cystéine, conduisant à la dénaturation des protéines individuelles dans les complexes sans perturber leur interaction.

Remplacez cette solution par un réactif alkylant, qui alkyle le groupe sulfhydryle des deux protéines dans les complexes et empêche la reformation des liaisons disulfure. Lavez la membrane pour éliminer tout excès de réactif.

Traitez la membrane avec un tampon contenant de la trypsine - une enzyme protéolytique. La trypsine clive la protéine cible marquée à la GFP et sa protéine partenaire à la terminaison carboxyle des résidus d’arginine et de lysine, libérant les peptides plus pe