Sonde peptidique biotinylée pénétrant dans les cellules pour détecter les interactions protéine-protéine

Dans les cellules, les protéines se lient à leurs protéines en interaction via des séquences spécifiques de leur structure, modulant le fonctionnement des protéines intracellulaires.

Pour détecter les interactions protéiques intracellulaires, prenez une culture cellulaire adhérente. Aspirez le support.

Ajoutez un peptide biotinylé pénétrant dans les cellules, une solution BCPP et incuber.

Chaque BCPP contient une séquence peptidique qui aide à la liaison spécifique à la protéine intracellulaire ciblée. Le peptide a un peptide pénétrant dans les cellules, le CPP, à l’extrémité N-terminale du peptide et de la biotine à l’extrémité C-terminale pour une détection facile.

Pendant l’incubation, la région CPP chargée positivement facilite l’entrée des peptides liés à travers la membrane de la cellule, atteignant le cytoplasme. Le peptide se lie à son partenaire protéique intercellulaire intracellulaire, formant un complexe protéique cible-BCPP.

Ajoutez un tampon contenant des molécules détergentes qui rompent la membrane de la cellule et libèrent des complexes protéiques cibles BCPP et d’autres composants cellulaires.

Ajoutez une solution d’avidine liée aux billes d’agarose - une glycoprotéine qui se lie spécifiquement à la biotine dans les BCPP. Incuber, permettant la liaison irréversible de l’avidine à la biotine et purifiant les complexes protéiques avidine-BCPP-cible.

Centrifuger pour granuler les billes. Remettre les billes en suspension dans un tampon pour cliver les liaisons non covalentes entre les protéines et éluer les complexes CPP-peptide-protéine des billes de biotine-avidine.

Analyser les complexes CPP-peptide-protéine par western blot. Une bande de poids moléculaire plus élevée pour le complexe CPP-peptide-protéine que pour les composants du complexe indique une interaction réussie entre les partenaires protéiques en interaction.

Ajoutez le volume de la solution mère de BCPP aux cultures cellulaires pour atteindre la concentration qui s’est avérée efficace.

Par conséquent, ajoutez 92,8 microlitres de 2 milligrammes par millilitre de TAT-Connexin-43_{266-283-Biotine} par millilitre de milieu de culture. Placez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes, pour vous assurer que les interactions entre le BCPP et ses partenaires intracellulaires ont lieu.

Pour effectuer l’extraction des protéines, il faut d’abord aspirer complètement le milieu de culture. Ensuite, lavez les cellules avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate glacée par 150 centimètres, très soigneusement pour éviter le détachement des cellules.

Pour obtenir le lysat cellulaire, ajoutez 3 millilitres de tampon de lyse par flacon de 150 centimètres carrés, et grattez soigneusement la surface à l’aide d’un grattoir cellulaire. En inclinant le ballon à environ 45 degrés, il sera plus facile de rassembler les lysats cellulaires dans leurs tubes correspondants.

Versez 1 millilitre de lysat cellulaire par tube dans 3 tubes de 1,5 millilitre marqués par condition. Pour le pull-down, centrifugez les tubes de 1,5 millilitre à 11 000 x g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.

Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes étiquetés A. Transférez une aliquote du surnageant par condition dans différents tubes étiquetés B. Ensuite, ajoutez 16,6 microlitres de tampon 4x Laemmli pour 50 microlitres de lysat et congelez à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, homogénéisez très bien l’agarose NeutrAvidin en l’agitant doucement.

Coupez les pointes des pointes de pipette pour augmenter leur diamètre et améliorer le pipetage des billes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’agarose NeutrAvidin par millilitre de lysat cellulaire dans les tubes A. Incuber les lysats cellulaires à 4 degrés Celsius pendant la nuit en les secouant très doucement pour permettre à NeutrAvidin d’interagir avec les BCPP liés à leurs partenaires intracellulaires.

Ensuite, centrifuger à 3 000 fois g pendant 1 minute à 4 % degrés Celsius pour recueillir le complexe de NeutrAvidin avec des protéines. Retirez soigneusement les surnageants et transférez-les dans des tubes propres étiquetés C. Gardez-les pour les utiliser au cas où le tirage ne réussirait pas.

Pour laver le complexe de NeutrAvidin avec des protéines, ajoutez un tampon de lyse fraîche aux granulés des tubes A. Remettre le granulé en suspension par inversion, et répéter la centrifugation. Répétez ce lavage cinq fois de plus. Tous ces surnageants peuvent être jetés.

Ensuite, ajoutez 40 microlitres de tampon 2x Laemmli par tube de 1,5 millilitre pour les granulés obtenus à partir de flacons de 150 centimètres carrés de cellules confluentes. Ensuite, éluez à 100 degrés Celsius pendant 5 minutes pour dissocier les interactions entre protéines.

Après l’élution, centrifuger pendant 30 secondes à 8 200 fois g pour granuler les billes de NeutrAvidin. Transférez les surnageants contenant les protéines dissociées avec des pointes capillaires dans de nouveaux tubes étiquetés D.

Ces surnageants sont maintenant prêts à être chargés dans un Western blot tel que décrit dans le protocole textuel, ou il peut être congelé à moins 20 degrés Celsius.