Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
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Pour le test à deux hybrides de levure, prenez une suspension de cellules de levure génétiquement modifiée, en croissance active, dépourvue de la protéine activatrice de transcription, GAL4. Ces cellules ne peuvent pas synthétiser la leucine et le tryptophane.
Ajoutez une paire de plasmides d’expression : l’un codant pour la leucine et le domaine de liaison à l’ADN, ADN-BD, de GAL4, fusionné à un domaine protéique cible, et l’autre codant pour le tryptophane et le domaine activateur, AD, de GAL4 fusionnés à un autre domaine de la protéine cible.
Ajoutez un tampon contenant les agents appropriés pour la transformation. Électrocutez les cellules pour provoquer la formation transitoire de pores, facilitant ainsi l’absorption des plasmides cellulaires. Refroidir pour refermer les pores. Plaquez les cellules sur un milieu de croissance sélective dépourvu de leucine et de tryptophane.
Les cellules transformées exprimant deux protéines hybrides synthétisent la leucine et le tryptophane, survivent et forment des colonies.
L’ADN-BD fusionné à un domaine protéique se lie à la séquence d’ADN spécifique en amont de la région promotrice du gène codant pour la β-galactosidase. Si les domaines pr
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