Essai de purification d’affinité en tandem pour étudier les interactions protéine-protéine

purification par affinité en tandem est un schéma de purification séquentielle permettant d’isoler des complexes protéiques à partir de cellules afin d’étudier les interactions protéine-protéine.

Pour commencer, prenez une culture cellulaire exprimant des protéines d’intérêt marquées d’épitopes. Les protéines forment un complexe à l’intérieur de la cellule. L’une des protéines du complexe contient un streptocoque, tandis que l’autre est marquée avec un FLAG-tag. Il s’agit de petits marqueurs d’affinité basés sur la séquence peptidique synthétique.

Retirez le milieu et ajoutez une solution détergente pour lyser les cellules. Centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires. Prélever le surnageant contenant le complexe protéique cible et d’autres protéines cellulaires.

Ajoutez des billes de streptocoque – des billes d’agarose enrobées de streptavidine – et incuberez. Le streptocoque du complexe protéique se lie à la streptavidine. Centrifugeuse pour recueillir les billes liées au complexe protéique. Laver pour éliminer toutes les protéines cellulaires contaminantes.

Ajoutez un tampon d’élution contenant de la desthiobiotine - un dérivé de la biotine - qui déplace le complexe protéique en se liant de manière compétitive à la streptavidine. Centrifugeuse pour obtenir un surnageant contenant le complexe protéique élué.

Ajoutez des billes FLAG – des billes d’agarose enrobées d’anticorps anti-FLAG – et incubez. Le FLAG-tag du complexe protéique se lie à l’anticorps. Centrifugeuse pour recueillir les billes liées au complexe protéique.

Ajouter un tampon d’élution contenant le peptide FLAG libre. Le peptide se lie de manière compétitive à l’anticorps et déplace le complexe protéique lié. Centrifugeuse pour éluer le complexe protéique purifié.

Évaluer la présence des deux protéines dans l’élué pour confirmer l’interaction entre les protéines d’intérêt.

Une fois que les mélanges de lysat cellulaire et de billes de streptocoque ont incubé pendant 2 heures, faites-les tourner à 1,1500 fois g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Conservez le surnageant sous la forme « STREP AP flow-through » et stockez-le à 4 degrés Celsius.

Ajoutez 500 microlitres de STREP AP Wash Buffer 1 aux billes. Nuter les billes et le mélange tampon pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius et centrifuger à 1 500 fois g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant et lavez-le à nouveau avec 500 microlitres de STREP AP Wash Buffer 1.

Après le troisième lavage, transférez la solution de billes dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour réduire le fond protéique. Lavez une quatrième fois avec le tampon de lavage STREP AP 1. Après l’essorage, retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage 2.

Équilibrez les billes en inversant les tubes, puis tournez-les à 1 500 fois g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant. Éluer la protéine d’intérêt avec 50 microlitres de tampon d’élution STREP. Vortex à 800 tr/min pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Faites tourner les perles à 1500 fois g pendant 1 minute à 4 degrés Celsius. Récupérez le surnageant. Cette fraction correspond à l’échantillon « STREP AP elution ».

Conservez la fraction des billes à 4 degrés Celsius pour une deuxième élution. Aliquote 10 % de l’élution du STREP AP pour la coloration à l’argent et/ou le western blot.

Afin d’augmenter la quantité de matière première pour l’immunoprécipitation ultérieure du FLAG, les première et deuxième élutions du STREP peuvent être regroupées pour une récupération plus efficace de l’élution du FLAG.

Commencez cette procédure en utilisant une pointe de pipette à large ouverture pour transférer la quantité appropriée de solution de billes FLAG dans un tube de microcentrifugation. Tournez à 1 500 fois g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage FLAG aux billes.

Tournez à 1 500 fois g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant et lavez-le à nouveau avec le tampon de lavage FLAG. Après le troisième lavage, retirez le surnageant et remettez les billes en suspension dans le tampon de lavage FLAG jusqu’à un volume final de n fois 16 microlitres où n est le nombre d’échantillons.

Ajoutez 16 microlitres de boue de billes FLAG à l’élution restante de STREP AP et nutez pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Après une incubation d’une nuit de la boue de billes FLAG et l’élution de STREP AP, procéder à l’immunoprécipitation FLAG.

Faites tourner les perles de suspension FLAG à 1 500 fois g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Enregistrez le surnageant en tant que « FLAG IP flow-through » et stockez-le à 4 degrés Celsius.

Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage FLAG aux billes. Nuter pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius et centrifuger à 1 500 fois g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant et lavez à nouveau avec 500 microlitres de tampon de lavage FLAG.

Après le troisième lavage, transférez la solution de billes de protéines dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour réduire le bruit de fond. Laver une quatrième fois avec le tampon de lavage FLAG. Retirez le surnageant de l’essorage final et ajoutez aux billes 30 microlitres de tampon de lavage FLAG contenant 200 nanogrammes par microlitre de peptide FLAG. Vortex à 800 tr/min pendant deux heures à 4 degrés Celsius.

Après deux heures, faites tourner la suspension à 1 500 fois g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Récoltez le surnageant et stockez-le à 4 degrés Celsius en tant qu'« élution FLAG IP ».