Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 6:34 min • July 8th, 2025
purification par affinité en tandem est un schéma de purification séquentielle permettant d’isoler des complexes protéiques à partir de cellules afin d’étudier les interactions protéine-protéine.
Pour commencer, prenez une culture cellulaire exprimant des protéines d’intérêt marquées d’épitopes. Les protéines forment un complexe à l’intérieur de la cellule. L’une des protéines du complexe contient un streptocoque, tandis que l’autre est marquée avec un FLAG-tag. Il s’agit de petits marqueurs d’affinité basés sur la séquence peptidique synthétique.
Retirez le milieu et ajoutez une solution détergente pour lyser les cellules. Centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires. Prélever le surnageant contenant le complexe protéique cible et d’autres protéines cellulaires.
Ajoutez des billes de streptocoque – des billes d’agarose enrobées de streptavidine – et incuberez. Le streptocoque du complexe protéique se lie à la streptavidine. Centrifugeuse pour recueillir les billes liées au complexe protéique. Laver pour éliminer toutes les protéines cellulaires contaminantes.
Ajoutez un tampon d’élution contenant de la desthiobiotine - un dérivé de la biotine - qui déplace le complexe pro
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