JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 6:05 min • July 8th, 2025
La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, ou RMN, permet la détection des interactions protéine-protéine au niveau atomique.
Pour étudier les interactions entre les protéines globulaires et hélicoïdales, marquez les protéines globulaires purifiées de type sauvage ou mutantes avec du 15N, un isotope de l’azote. Dans un tube RMN, mélangez les protéines globulaires marquées et les protéines hélicoïdales non marquées dans un solvant contenant un étalon RMN. Insérez le tube dans le spectromètre RMN.
Les aimants du spectromètre génèrent un champ magnétique puissant, alignant les noyauxde protéines globulaires 15 marqués N parallèlement au champ. Une impulsion de radiofréquence, ou RF, excite les 15noyaux N pour qu’ils s’alignent antiparallèlement au champ.
La fréquence d’impulsion nécessaire à la transition des noyaux 15N entre les deux états définit la fréquence de résonance. La normalisation de la fréquence de résonance 15N par rapport à la norme RMN mesure le décalage chimique 15N.
Le champ magnétique est ajusté pour aligner les noyaux 1H – liés à 15N – parallèlement au champ. Les impulsions RF sont ajustées et le décalage chimique de 1H est enregistré.
Au cours des interactions protéiques, l’environnement chimique entourant les résidus d’acides aminés en interaction change, modifiant les liaisons chimiques 15 N-1H et les changements chimiques correspondants. Tracez les 15spectres RMN N-1H.
Sans protéines hélicoïdales, les protéines globulaires de type sauvage présentent des pics spectraux bien résolus. Lorsque les protéines globulaires hélicoïdales et de type sauvage interagissent, le pic spectral est réduit. En revanche, l’incubation de protéines hélicoïdales avec des protéines globulaires mutantes entraîne la réapparition des pics spectraux, indiquant qu’il n’y a pas d’interaction entre eux.
Activez le flux d’air avec la commande d’éjection « ej ». Cela fera remonter l’échantillon de l’aimant. Maintenant, placez l’échantillon dans une toupie au-dessus de l’aimant dans l’ouverture. Insérez avec la commande « ij ». Attendez que l’échantillon se dépose à l’intérieur de l’aimant avant de continuer.
Créez un nouvel ensemble de données à l’aide de la commande « edc » et chargez les paramètres RMN standard de Proton en sélectionnant l’expérience « ZGPR ». Renseignez les champs nom, numéro de l’expérience et numéro du dossier de données traitées.
Sélectionnez le solvant dans le champ « Régler le solvant » et cliquez sur « Exécuter 'getprosol' » pour lire la tête de sonde standard et les paramètres dépendants du solvant. Verrouillez l’échantillon sur le solvant deutéré à l’aide de la commande « Lock » et attendez qu’il ait terminé le balayage et réalisé le verrouillage.
Corrigez la fréquence de résonance de l’aimant en accordant l’échantillon à l’aide de la commande d’accord automatique « atma ». Surveillez la courbe d’oscillation jusqu’à ce que le réglage automatique soit terminé.
Cale le champ magnétique à l’aide de « TOPSHIM ». Le shimming ajuste le champ magnétique pour obtenir une uniformité autour de l’échantillon. Il est recommandé de stocker les mêmes valeurs avec la commande « wsh » et de les lire en utilisant « rsh » avant topshim si vous utilisez des échantillons identiques ou similaires.
Maintenant, ajustez le gain du récepteur avec la commande « rga » pour obtenir le rapport signal/bruit maximal. Placez le centre du spectre sur le décalage de résonance de l’eau et réglez l’impulsion de protons de 90 degrés à haute puissance à l’aide de « calibo1p1 ».
Collectez le spectre des protons à l’aide de la commande Zero Go « zg » et traitez avec « efp ». Cela inclut la multiplication exponentielle, la décroissance de l’induction libre incorporant l’élargissement de la ligne, la transformation de Fourier de la FID et « pk » pour appliquer la correction de phase.
Appliquez la correction de phase automatique « apk » et la correction de base automatique « absn » en utilisant l’option polynomiale sans intégration. Créez un nouvel ensemble de données pour l’expérience SOFAST HMBC en sélectionnant « SFHMQC3GPPH » dans l’expérience.
Copiez les impulsions P1 et O1 optimisées du spectre des protons et remplissez les impulsions dépendantes de P1 à l’aide de la commande « getprosol 1H p1 plw1 » où P1 est la valeur P1 optimisée et plw1 est le niveau de puissance pour P1. Maintenant, optimisez la constante CNST54 pour définir le décalage pour le déplacement chimique de l’amide. Optimisez également CNST55 pour définir la bande passante afin d’englober les régions spectrales d’intérêt, ce qui permet d’optimiser le gain du récepteur.
Pour sélectionner ces paramètres, extrayez le premier FID du spectre bidimensionnel et recherchez le signal observé pour les définir. De plus, variez le délai de relaxation, le nombre de balayages et les balayages factices pour obtenir une sensibilité de signal acceptable avec la commande « gs », qui permet de surveiller la qualité des données en temps réel. Enfin, enregistrez les spectres à l’aide de Zero Go « zg ».