Utilisation de l’affichage des phages pour sélectionner des protéines ayant une forte affinité pour une protéine cible

Commencez l’affichage des phages en ajoutant une bibliothèque de phages dans les puits d’une plaque multi-puits, recouverte de protéine cible. La bibliothèque de phages contient des phages génétiquement modifiés, chacun présentant une variante protéique individuelle fusionnée à une protéine d’enveloppe à sa surface. Incuber, permettant au phage et aux protéines cibles d’interagir.

Les phages contenant des protéines ayant une affinité élevée pour la protéine cible se lient à la protéine cible. Laver avec un tampon, en éliminant les phages non liés. Ajoutez une solution acide, perturbant les interactions entre le phage et les protéines cibles, libérant des phages dans la solution. Neutralisez le pH de la solution à l’aide d’un tampon, en maintenant la stabilité du phage.

Transférez les phages dans un tube frais. Incuber avec une solution bloquante contenant des protéines, empêchant les interactions non spécifiques.

Transférez les phages dans une suspension d’E. coli à division active, infectant les bactéries et initiant le cycle de réplication des phages. Complétez avec des phages auxiliaires, qui infectent les bactéries, fournissant les protéines d’enveloppe nécessaires à l’emballage des phages de descendance. Transférez la suspension dans un milieu sélectif, permettant la croissance des bactéries infectées par les phages.

Les phages de la descendance finissent par être libérés dans le milieu. Centrifugeuse. Prélever le surnageant contenant des phages. Ajouter une solution de précipitation en concentrant les particules de phage. Centrifugeuse. Remettre en suspension la pastille de phage dans un tampon, en obtenant une suspension homogène.

Répétez la liaison phage-protéine cible, l’élution avec une plus grande rigueur de lavage du tampon, et les étapes d’amplification et de centrifugation, entraînant l’enrichissement des pools de phages présentant des protéines ayant une grande affinité pour la protéine cible.

Décongelez la ludothèque sur de la glace. Ensuite, diluez-le à 100 fois la diversité des bibliothèques dans PBS. Ajouter la solution de polyéthylène glycol/chlorure de sodium à 1/5e du volume dilué de la bibliothèque et incuber la solution sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez la solution à 11 000 fois g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et centrifugez-le pendant encore deux minutes pour extraire le surnageant restant et concentrer la pastille de phage.

Remettez doucement en suspension la pastille de phage dans un millilitre de tampon PBT par protéine cible à analyser, généralement quatre au total. Ajouter 100 microlitres de phagethèque à chaque puits enrobé de la plaque de contrôle. Incuber à température ambiante pendant une heure avec une agitation orbitale de 300 tr/min.

Jetez le tampon PB de la plaque cible dans l’évier et séchez l’assiette sur du papier absorbant. Transférez les 100 microlitres de la bibliothèque de phages dans la plaque de contrôle vers chaque puits enrobé de la plaque cible. Incuber à température ambiante pendant une heure avec une agitation orbitale de 300 tr/min.

Ensuite, retirez la bibliothèque de phages de la plaque et lavez les puits enrobés quatre fois avec un tampon PT. Retournez l’assiette et tapotez sur une serviette en papier pour retirer les dernières gouttes de tampon. Ajoutez 100 microlitres d’acide chlorhydrique 0,1 molaire dans chaque puits enrobé pour éluer le phage. Incuber la plaque à température ambiante pendant 5 minutes en secouant orbitalement à 300 tr/min.

Après cela, neutralisez le pH en ajoutant 12,5 microlitres de chlorhydrate de Tris de pH 11 une molaire à chaque puits enrobé. Transférez le phage élué des huit puits dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Pipetez de haut en bas pendant le transfert pour rendre les solutions homogènes et aspirez tout le liquide des puits. Ajoutez 10 % de BSA au phage élué pour obtenir la concentration finale de 1 %.

Rangez le tube de microcentrifugation à quatre degrés Celsius. Il s’agit de la sortie du premier tour. Préparez une culture de semences pour la culture du phage en vue de la prochaine ronde de sélection en inoculant cinq millilitres de culture de semences de 2YT/Tetracycline avec une colonie isolée d’E. coli à partir d’une plaque de gélose.

Incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une secousse orbitale de 200 tr/min. Diluez la protéine cible dans les tubes des deuxième et troisième tours avec une quantité appropriée de PBS. Prenez la moitié du contenu du tube des cycles deux et trois et enrobez quatre puits par protéine cible dans une plaque de liaison à 96 puits pour le tour suivant.

Ensuite, utilisez la moitié de la sortie ronde pour inoculer trois millilitres de cellules en phase mi-logarithmique. Incuber-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec une secousse orbitale de 200 tr/min. Ajouter M13KO7 Helper Phage à une concentration finale de 10 milliards de pfu par millilitre. Incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant une heure avec une secousse orbitale de 200 tr/min.

Après une heure, transférez les trois millilitres entiers de culture dans 30 millilitres de solution 2YT/Carbenicilline/Kanamycin. Cultivez pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une secousse orbitale de 200 tr/min.