Immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines cibles sur l’ADN génomique

Pour identifier les sites de liaison d’une protéine cible sur l’ADN, commencez par des cellules précurseurs d’oligodendrocytes contenant une protéine cible réticulée à des séquences d’ADN spécifiques dans la chromatine.

Traitez les cellules avec un tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéase. Le tampon de lyse lyse les cellules, tandis que les inhibiteurs inactivent les protéases pour conserver l’intégrité des complexes protéine-chromatine.

Sonicez le contenu pour cisailler les complexes en fragments de chromatine plus petits, certains conservant la protéine cible.

Centrifuger pour granuler les composants cellulaires et transférer le surnageant contenant des fragments de chromatine dans un tube frais. Incuber avec des anticorps anti-cibles qui se lient spécifiquement à la protéine cible sur les fragments de chromatine.

Complétez le tube avec des billes magnétiques enrobées de protéine A qui se lient à la région Fc des anticorps pré-liés. Appliquez un champ magnétique pour précipiter sélectivement les protéines cibles liées aux anticorps complexées avec des fragments de chromatine.

Traitez les complexes de billes avec un tampon d’élution à haute teneur en sel pour perturber les interactions protéine-chromatine et libérer l’ADN nu sans protéines associées.

Utilisez des solvants organiques pour extraire l’ADN. Ajoutez un tampon d’amplification et exécutez une réaction en chaîne par polymérase pour amplifier les fragments d’ADN. Post-amplification, analysez la séquence d’ADN.

Comparez la séquence des produits amplifiés à la séquence d’ADN génomique de la cellule. Trouvez la région avec une correspondance de séquence entre le fragment et l’ADN génomique, en corrélation avec les sites de liaison aux protéines.

Après avoir compté dans un hémocytomètre, ajoutez 20 000 OPC purifiés dans 1 millilitre de milieu de culture cellulaire OPC pour la réaction ChIP. Ensuite, ajoutez 27 microlitres de 36,5 % de formaldéhyde à température ambiante pendant 10 minutes. Cela fixera les cellules.

Après 10 minutes, ajoutez 50 microlitres de glycine à 2,5 molaires sur les cellules fixes pendant 5 minutes à température ambiante. L’ajout de glycine arrêtera la réticulation ADN-protéines. Ensuite, lavez les cellules réticulées avec 1 millilitre de tampon HBSS avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, centrifugez les cellules dans une centrifugeuse pré-refroidie à 300 fois g à 4 degrés Celsius.

Après la réticulation des OPC purifiés, les cellules réticulées doivent être lavées à l’aide d’une solution HBSS glacée, et les étapes restantes de ChIP doivent être effectuées à 4 degrés. Sinon, l’anticorps ne peut pas précipiter correctement l’ADN génomique.

Ensuite, ajoutez 25 microlitres de tampon de lyse complet à la pastille cellulaire et laissez sur la glace pendant 5 minutes. Ensuite, pipetez 75 microlitres de tampon HBSS glacé avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, cisaillez la chromatine du lysat cellulaire dans un système de sonication pré-refroidi avec cinq cycles de 30 secondes de marche et de 30 secondes de programme OFF.

Une fois la chromatine cisaillée, centrifugez le lysat cellulaire à 14 000 fois g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. À la fin de la centrifugation, récupérez le surnageant. Ensuite, diluez 100 microlitres de chromatine cisaillée avec un volume égal de tampon ChIP glacé avec inhibiteur de protéase.

Ensuite, ajoutez 1 microlitre d’anticorps anti-olig2 de lapin à 180 microlitres de chromatine cisaillée diluée. Incuber les tubes sur une roue rotative pendant 16 heures à 4 degrés Celsius à 40 tours par minute. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de billes prélavées enrobées de protéine A dans le tube de réaction ChIP dans une chambre froide. Encore une fois, incubez les tubes ChIP à 4 degrés Celsius pendant encore 2 heures sur la roue rotative.

Après 2 heures, laissez le tube de réaction ChIP sur la grille magnétique pendant une minute. Ensuite, lavez la bille de billes avec 100 microlitres de quatre tampons de lavage chacun pendant 4 minutes sur une roue rotative à 4 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon d’élution à la pastille de bille. Incuber le tube de réaction à 65 degrés Celsius pendant 4 heures.

Une fois que l’ADN double brin est dénaturé, déphosphorylez l’extrémité 3-prime de l’ADN simple brin en ajoutant de la phosphatase alcaline de crevette. Ensuite, ajoutez une queue poly(T) à l’ADN simple brin à l’aide de la désoxynucléotidyltransférase terminale. Ensuite, recuit l’amorce poly-(dA) de l’ADN sur la matrice d’ADN simple brin. Ensuite, amplifiez la bibliothèque de séquences ChIP à l’aide d’amorces directes et inverses pour l’indexation.

Le nombre de cycles de PCR pour la préparation de la banque dépend de la quantité d’ADN de départ. Une bonne préparation de banque nécessite une quantification précise de la quantité d’ADN d’entrée. Trop ou trop peu de cycles de PCR peuvent influencer la concentration de la bibliothèque ainsi que la complexité, conduisant à des artefacts de PCR.

À l’aide de billes paramagnétiques, sélectionnez les fragments allant de 250 à 500 paires de bases dans la bibliothèque de séquences ChIP amplifiée par PCR. Utilisez un dispositif d’électrophorèse capillaire microfluidique ChIP pour examiner la qualité de la bibliothèque de séquences ChIP sélectionnée.