Anisotropie de fluorescence pour déterminer l’affinité de liaison entre le facteur de transcription et l’ADN
JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 5:00 min • July 8th, 2025
Le facteur de transcription, TF, est une protéine qui se lie à la région spécifique de l’ADN d’un gène et régule la transcription.
Pour mesurer les interactions TF-ADN par anisotropie de fluorescence, prenez une plaque multi-puits. Ajouter au puits un gel fondu mélangé à une solution tamponnée, contenant des concentrations connues d’ADN de référence marqué au fluorophore comprenant un site de liaison au TF et une concentration plus élevée de molécules de TF, et incuber.
Au fur et à mesure que l’ADN de référence marqué se distribue dans le gel, une concentration plus élevée de molécules de TF garantit que toutes les molécules d’ADN sont liées au TF. Ajouter une solution tamponnée contenant de l’ADN concurrent non marqué avec une mutation ponctuelle.
Analysez le gel de la plaque à l’aide de la microscopie à anisotropie à fluorescence haute performance.
La lumière polarisée excite le fluorophore lié à l’ADN de référence, qui se réoriente en raison du culbutage moléculaire et émet une lumière dépolarisée multidirectionnelle - un phénomène appelé anisotropie de fluorescence, FA.
Lors de la liaison au TF, le poids moléculaire du fluorophore lié à l’ADN de référence augmente et il culbute plus lentement, émettant plus de lumière polarisée qui augmente l’AF.
L’ADN concurrent non marqué se diffuse à travers la matrice de gel au fil du temps, formant un gradient de concentration élevé à faible. Une concentration plus élevée d’ADN concurrent non marqué déplace l’ADN de référence marqué, se liant à TF. Les oligomères de référence marqués libérés culbutent plus rapidement, ce qui diminue le FA.
Tracez le gradient de concentration de l’AF du fluorophore et de l’ADN concurrent au fil du temps, qui diminue à mesure que davantage de molécules d’ADN concurrentes déplacent l’ADN de référence.
Pour préparer les puits de titrage et d’étalonnage d’une plaque à 96 puits, transférez deux aliquotes de stock de gel dans un agitateur d’incubateur à 75 degrés Celsius.
Pour chaque puits de titrage, ajoutez 1,4 nanomole d’ADN de référence, la protéine du facteur de transcription à une concentration finale de 20 à 60 nanomoles, 0,2 millimolaire de DTT et le tampon de liaison à 240 microlitres de gel fondu.
Mélangez soigneusement en inversant et en secouant le tube. Ensuite, pipetez lentement 200 microlitres par puits de gel contenant de l’ADN dans les puits de titrage désignés d’une plaque de 96 puits. Pour chaque puits de calibrage, ajoutez 5 nanomoles de colorant bleu du Nil à 240 microlitres de gel fondu. En évitant les bulles d’air, pipetez lentement 200 microlitres de la solution de gel contenant du colorant dans cinq à six puits de la plaque à 96 puits.
Placez le gel sur une surface parfaitement horizontale et incubez pendant 10 minutes à température ambiante, puis 10 minutes à 4 degrés Celsius. À l’aide d’un lecteur de plaques multipuits, vérifiez l’homogénéité des niveaux de hauteur du gel dans les différents puits de la plaque.
Pour préparer la solution d’ADN concurrente, combinez d’abord l’ADN de référence marqué, la protéine et le tampon de liaison concentré en trois fois. Ensuite, mélangez 20 microlitres de la solution avec 40 microlitres de chacune des solutions d’ADN recuites des concurrents.
Pour chaque puits d’étalonnage, combinez les quantités appropriées de l’une des solutions d’ADN concurrentes recuites et le tampon de liaison concentré trois fois contenant une solution de colorant bleu du Nil de 15 millimolaires. Enfin, ajoutez 50 microlitres des solutions mixtes concurrentes sur les gels aussi simultanément que possible.
Pour commencer l’acquisition d’images, placez la plaque à 96 puits sur la platine du microscope. Ensuite, prenez des séries chronologiques d’images z-stack de puits jusqu’à la déliaison complète de la protéine de l’ADN de référence.
Effectuez le dosage du titrage en fonction du manuscrit. Ensuite, utilisez le logiciel HiP-FA pour créer des courbes de titrage pour des séquences concurrentes individuelles. Ensuite, cliquez sur le bouton « Exporter » pour obtenir la constante de dissociation et la concentration de la protéine active dans chaque puits de titrage.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de mesurer les interactions entre facteurs de transcription (TF) et ADN à l'aide de l'anisotropie de fluorescence. Le protocole consiste à préparer une plaque multi-puits contenant un gel avec de l'ADN marqué par un fluorophore et un facteur de transcription, suivie d'une analyse par microscopie d'anisotropie de fluorescence haute performance.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Biologie moléculaire
- Microscopie de fluorescence
Contexte
- Les facteurs de transcription sont des protéines qui régulent l'expression des gènes en se liant à des régions spécifiques de l'ADN.
- L'anisotropie de fluorescence est une technique utilisée pour étudier les interactions moléculaires.
- La compréhension des interactions entre les facteurs de transcription et l'ADN est essentielle pour obtenir des informations sur la régulation génique.
- Cette méthode permet une surveillance en temps réel de ces interactions.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour quantifier les interactions entre facteurs de transcription et ADN.
- Utiliser l'anisotropie de fluorescence afin de mesurer les changements de la dynamique moléculaire lors de la liaison.
- Fournir un protocole détaillé à l'intention des chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une plaque multi-puits contenant un gel avec l'ADN de référence et le facteur de transcription (TF).
- Incorporation d'ADN compétiteur pour évaluer la dynamique de liaison.
- Utilisation d'une microscopie d'anisotropie de fluorescence haute performance pour l'analyse.
- Analyse des données à l'aide du logiciel HiP-FA afin de générer des courbes de titrage.
Résultats principaux
- Mesure réussie des interactions TF-ADN par anisotropie de fluorescence.
- Démonstration de l'impact de l'ADN compétiteur sur la dynamique de liaison.
- Génération de courbes de titrage indiquant les constantes de dissociation.
- Validation de l'efficacité de la méthode pour la surveillance en temps réel.
Conclusions
- La méthode développée fournit une approche robuste pour l'étude des interactions facteur de transcription-ADN.
- L'anisotropie de fluorescence est efficace pour l'analyse en temps réel de la liaison moléculaire.
- Ce protocole peut être adapté à divers facteurs de transcription et séquences d'ADN.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La quantification de l'affinité de liaison entre les facteurs de transcription et l'ADN est essentielle pour la validation des cibles en phase précoce de découverte de médicaments, permettant d'éliminer les risques liés aux hypothèses sur la régulation génique. L'anisotropie de fluorescence fournit une détection en phase liquide basée sur un marquage, qui soutient le développement de tests pour des campagnes de criblage ciblant les interfaces protéine-ADN. Cette méthode fournit des constantes de dissociation quantitatives qui éclairent l'identification des composés leaders et renforcent la confiance prédictive dans les modulateurs transcriptionnels.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Mesure l'affinité de liaison entre des facteurs de transcription et des séquences d'ADN spécifiques afin de valider des hypothèses thérapeutiques.
- Valeur opérationnelle : Utilise une titration compétitive pour évaluer la spécificité et la puissance de déplacement de molécules candidates.
- Valeur prédictive : Génère des courbes de titration et des constantes de dissociation qui soutiennent la confiance dans la cible et son classement par ordre de priorité.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Permet la surveillance en temps réel des interactions entre facteurs de transcription et ADN dans un format homogène en solution.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les formats de plaques multi-puits, permettant le criblage à débit moyen de bibliothèques de composés.
- Préparation du test : Génère des signaux d'anisotropie de fluorescence qui corrélonnent directement avec les fractions d'ADN liées par rapport aux fractions libres.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet des études mécanistiques des voies de régulation génique pertinentes pour les modèles de maladies.
- Alignement sur les biomarqueurs : Peut être adapté pour évaluer l'activité des facteurs de transcription dans des contextes cellulaires liés aux maladies.
- Réduction des risques précliniques : Fournit des données quantitatives sur la liaison afin d'informer les études d'engagement ciblé in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de l'hypothèse sur la cible jusqu'au développement de tests et à l'optimisation du composé candidat, en particulier pour les cibles impliquant une régulation transcriptionnelle.
- Biologie de la découverte : Valide la liaison facteur de transcription-ADN comme mécanisme ciblable par des médicaments et précise la spécificité du site de liaison.
- Écrans de molécules : Permet le développement de tests basés sur l'anisotropie de fluorescence pour l'analyse de petites molécules ou de peptides perturbant les interactions protéine-ADN.
- Analytique : Fournit les constantes de dissociation et les concentrations de protéine active à partir de courbes de titrage, permettant une comparaison quantitative des conditions de liaison.
- Recherche translationnelle : Relie les données de liaison in vitro à l'activité transcriptionnelle cellulaire lorsqu'elles sont combinées à des mesures fonctionnelles.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme biophysique réutilisable pour la caractérisation de divers facteurs de transcription et séquences d'ADN à travers différents projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique concernant la fonction des facteurs de transcription grâce à des mesures directes et quantitatives de la liaison.
- Valeur opérationnelle : Fournit des données reproductibles en phase liquide avec une consommation minimale d'échantillon et sans artefacts liés à l'immobilisation.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant dès les premières étapes des données d'affinité et de spécificité pour les cibles transcriptionnelles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression des composés ajustée au risque, fondée sur un engagement de cible validé au niveau de la liaison à l'ADN.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie de fluorescence et en tests d'interaction protéine-acide nucléique.
- Dépend de l'accès à un appareil de mesure de l'anisotropie de fluorescence haute performance et à une préparation d'échantillons par électrophorèse sur gel.
- Exige une conception minutieuse d'oligonucléotides d'ADN marqués et concurrents afin d'assurer la spécificité.
- Implique l'optimisation de la concentration du facteur de transcription et des conditions d'incubation pour atteindre un état d'équilibre de la liaison.
- Limité aux facteurs de transcription solubles et aux cibles d'ADN accessibles ; peut ne pas refléter les états chromatiniens in vivo.
Foire aux questions en biopharmacie
Écrans un hybride levure améliorée afin d’identifier le facteur de Transcription lie à des séquences de l’ADN humain
Vidéos connexes
0 Vues
Utilisation de la thermophorèse à micro-échelle pour mesurer les interactions protéine-lipide
Vidéos connexes
0 Vues
Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme
Vidéos connexes
0 Vues
Détection des interactions protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence
Vidéos connexes
0 Vues
Essai de décalage de mobilité électrophorétique pour la détection de complexes facteur de transcription-ADN
Vidéos connexes
0 Vues
Un dosage quantitatif pour l'étude de protéines: ADN Interactions, Découverte de transcription régulateurs de l'expression des gènes, et identifier les agents anti-tumoraux
Vidéos connexes
0 Vues
Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine
Vidéos connexes
0 Vues
Formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères
Vidéos connexes
0 Vues
Haute sensibilité mesure des affinités de liaison de l’ADN-facteur de Transcription par titrage concurrentiel à l’aide de la microscopie en Fluorescence
Vidéos connexes
0 Vues
Détermination de l’interaction tripartite entre deux monomères d’un facteur de transcription MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium par essai BiFC-FRET-FLIM
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 29 août 2026