Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 5:00 min • July 8th, 2025
Le facteur de transcription, TF, est une protéine qui se lie à la région spécifique de l’ADN d’un gène et régule la transcription.
Pour mesurer les interactions TF-ADN par anisotropie de fluorescence, prenez une plaque multi-puits. Ajouter au puits un gel fondu mélangé à une solution tamponnée, contenant des concentrations connues d’ADN de référence marqué au fluorophore comprenant un site de liaison au TF et une concentration plus élevée de molécules de TF, et incuber.
Au fur et à mesure que l’ADN de référence marqué se distribue dans le gel, une concentration plus élevée de molécules de TF garantit que toutes les molécules d’ADN sont liées au TF. Ajouter une solution tamponnée contenant de l’ADN concurrent non marqué avec une mutation ponctuelle.
Analysez le gel de la plaque à l’aide de la microscopie à anisotropie à fluorescence haute performance.
La lumière polarisée excite le fluorophore lié à l’ADN de référence, qui se réoriente en raison du culbutage moléculaire et émet une lumière dépolarisée multidirectionnelle - un phénomène appelé anisotropie de fluorescence, FA.
Lors de la liaison au TF, le poids moléculaire du fluorophore lié à l’ADN de référence augmente et il culbute
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