Dosage de la répression génique rapporteure pour étudier la régulation translationnelle d’un gène cible

Les protéines de liaison à l’ARN, les RBP, fonctionnent comme des régulateurs post-transcriptionnels en se liant à la région d’initiation de la traduction, TIR, de l’ARNm et en réprimant la traduction.

Pour étudier les interactions ARN-RBP via la répression translationnelle d’un gène rapporteur, prenez une culture cellulaire bactérienne contenant deux plasmides - le site de liaison et les plasmides RBP.

Le plasmide du site de liaison code pour un gène rapporteur fluorescent. Lors de la transcription, le TIR de l’ARNm résultant contient un site de liaison au ribosome et une structure en épingle à cheveux, avec une séquence reconnue par les RBP.

Les ribosomes se lient au site de liaison sur l’ARNm et déstabilisent la structure en épingle à cheveux, conduisant à la traduction de l’ARNm et à la formation de protéines rapporteures fluorescentes. Le plasmide RBP exprime une RBP chimérique fusionnée à une protéine fluorescente différente. Un promoteur inductible contrôle l’expression de la protéine chimérique.

Ajoutez l’inducteur, qui active un facteur de transcription qui se lie au promoteur, induisant l’expression de protéines chimériques. La RBP de la protéine chimérique se lie à la st