Dosage de la répression génique rapporteure pour étudier la régulation translationnelle d’un gène cible

Les protéines de liaison à l’ARN, les RBP, fonctionnent comme des régulateurs post-transcriptionnels en se liant à la région d’initiation de la traduction, TIR, de l’ARNm et en réprimant la traduction.

Pour étudier les interactions ARN-RBP via la répression translationnelle d’un gène rapporteur, prenez une culture cellulaire bactérienne contenant deux plasmides - le site de liaison et les plasmides RBP.

Le plasmide du site de liaison code pour un gène rapporteur fluorescent. Lors de la transcription, le TIR de l’ARNm résultant contient un site de liaison au ribosome et une structure en épingle à cheveux, avec une séquence reconnue par les RBP.

Les ribosomes se lient au site de liaison sur l’ARNm et déstabilisent la structure en épingle à cheveux, conduisant à la traduction de l’ARNm et à la formation de protéines rapporteures fluorescentes. Le plasmide RBP exprime une RBP chimérique fusionnée à une protéine fluorescente différente. Un promoteur inductible contrôle l’expression de la protéine chimérique.

Ajoutez l’inducteur, qui active un facteur de transcription qui se lie au promoteur, induisant l’expression de protéines chimériques. La RBP de la protéine chimérique se lie à la structure en épingle à cheveux. Cela empêche le ribosome de se lier à l’ARNm, inhibant la traduction de la protéine rapporteure.

Avec l’augmentation de la concentration de l’inducteur, la production de RBP augmente, ce qui entraîne une inhibition compétitive plus forte de la liaison ribosomique à l’ARNm.

Mesurez les différents signaux de fluorescence des protéines chimériques et rapporteures. Tracez les signaux, en obtenant la courbe dose-réponse.

Avec l’augmentation de la production de RBP médiée par l’inducteur, la répression traductionnelle réduit la concentration de la protéine rapporteure, confirmant l’interaction ARN-RBP.

Transformer les plasmides préparés en cellules bactériennes chimiquement compétentes contenant déjà un plasmide RBP-mCerulean. Pour gagner du temps, plaquez les cellules à l’aide d’une pipette à 8 canaux sur des plaques à 8 voies contenant de la gélose Luria-Bertani avec des antibiotiques appropriés. Les colonies devraient apparaître dans 16 heures à 37 degrés Celsius.

Sélectionnez une seule colonie pour chaque transformant double et transférez-la dans des plaques de 48 puits contenant 1,5 millilitre de LB avec les antibiotiques appropriés. Cultivez les cellules sur une période de 18 heures à 37 degrés Celsius en secouant à 250 tr/min. Conservez les stocks de glycérol de la nuit à -80 degrés Celsius dans des plaques à 96 puits.

Le matin, programmez le robot pour réchauffer 180 microlitres de milieu semi-pauvre, ou SPM, dans des plaques de 96 puits. Programmez le robot pour préparer la plaque inductrice.

Dans une plaque propre de 96 puits, préparez des puits avec des SPM composés de 95 % de BA et de 5 % de LB. Le nombre de puits correspond au nombre souhaité de concentrations d’inducteurs. Ajouter du C4-HSL dans les puits de la plaque d’inducteur qui contiendra la concentration d’inducteur la plus élevée.

Ensuite, programmez le robot pour diluer en série le milieu de chacun des puits les plus concentrés en 23 concentrations inférieures allant de 0 à 218 nanomolaires. Le volume de chaque dilution de l’inducteur doit être suffisant pour toutes les souches.

Pour diluer les souches de nuit, programmez le robot pour qu’il dilue par un facteur 10 en mélangeant 20 microlitres de bactéries avec 180 microlitres de SPM dans des plaques de 48 puits. Ensuite, diluez à nouveau d’un facteur 10 en prélevant 20 microlitres de la solution diluée dans la plaque de contrainte pré-préparée adaptée aux mesures fluorescentes.

Maintenant, programmez le robot pour qu’il ajoute l’inducteur dilué de la plaque d’inducteur aux plaques à 96 puits avec les souches diluées en fonction des concentrations finales. Secouez les plaques à 96 puits à 37 degrés Celsius pendant 6 heures. Pendant ce temps, prenez des mesures de la densité optique ou OD à 595 nanomètres, ainsi que de la fluorescence mCherry et mCerulean via un lecteur de plaques toutes les 30 minutes.