Mesure de l’activité hélicase d’une protéine cible à l’aide de duplex d’ARN marqués à la biotine

Les protéines ayant une activité d’ARN hélicase peuvent aider à dérouler et à séparer les molécules d’ARN individuelles dans un duplex d’ARN.

Pour déterminer l’activité hélicase d’une protéine, prenez des tubes contenant un mélange de duplex d’ARN marqués à la biotine avec un surplomb de 5', d’ATP et de pièges à ARN - des brins non marqués complémentaires aux brins biotinylés des duplex.

Ajoutez la protéine à activité hélicase dans chaque tube et incubez pendant des durées différentes. La protéine se lie au surplomb de 5 pieds des duplex.

À l’aide de molécules d’ATP, il brise les liaisons hydrogène entre deux brins duplex, ce qui entraîne leur déroulement et la libération de l’ARN simple brin biotinylé. Les pièges à ARN interagissent avec les brins marqués à la biotine, empêchant le recuit avec les brins séparés.

Terminez la réaction à l’aide d’un tampon de terminaison.

Chargez les échantillons dans différents puits d’un gel de polyacrylamide natif. Exécutez l’électrophorèse. L’ARN monocaténaire de faible poids moléculaire se déplace plus rapidement que les duplex de haut poids moléculaire. Ce déplacement de mobilité génère deux bandes distinctes.

Épongez le gel sur une membrane en nylon, en transférant les ARN à la membrane. Après le transfert, exposez la membrane à la lumière UV, en réticulant les ARN sur la membrane.

Ajoutez de la streptavidine conjuguée aux enzymes chimiluminescentes, qui interagit avec la biotine sur les duplex et les brins monocaténaires. Utilisez des substrats chimiluminescents pour produire des produits de chimiluminescence.

Lors de l’imagerie, l’intensité de la bande de faible poids moléculaire augmente avec le temps, en corrélation avec l’activité hélicase de la protéine cible.

Pour le dosage de l’activité hélicase MOV10, mélangez les réactifs selon les instructions du manuscrit et ajoutez de l’eau pour un volume de réaction final de 20 microlitres. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, 30 minutes et 60 minutes, puis ajoutez 5X Stop Buffer pour arrêter la réaction. Ensuite, préparez un gel de polyacrylamide natif à 20 % et chargez 20 à 25 microlitres de chaque échantillon dans chaque puits. Faites couler le gel à 100 volts dans un bain de glace jusqu’à ce que le marqueur bleu de bromophénol ait migré vers le quart inférieur du gel.

L’acrylamide est nocif et toxique. Il est important de le manipuler avec un équipement de protection individuelle approprié.

Démontez les plaques de gel et coupez le gel en enlevant les puits de chargement et les voies inutilisées. Placez le gel dans un tampon TBE 0,5X. Coupez le papier filtre et la membrane en nylon à la taille du gel, pré-mouillez le papier et la membrane et assemblez la pile pour le transfert.

Transférez les échantillons du gel à la membrane dans un appareil électrophorétique semi-sec à 90 milliampères pendant 20 minutes. Ensuite, réticulez les échantillons en irradiant la membrane à 120 millijoules par centimètre carré pendant 45 à 60 secondes.

Pour la détection de la chimiluminescence, commencez par ajouter 20 millilitres de tampon de blocage à la membrane et incubez-la pendant 15 à 30 minutes tout en secouant doucement. Retirez soigneusement le tampon de blocage et remplacez-le par un tampon de blocage conjugué. Incuber à nouveau la membrane pendant 15 minutes.

Lavez la membrane quatre fois en secouant pendant 5 minutes par lavage. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de tampon d’équilibrage du substrat à la membrane et incubez-la pendant 5 minutes en l’agitant à 20 à 25 tr/min.

Couvrez toute la surface de la membrane avec une solution de travail de substrat et incubez pendant 5 minutes. Après l’incubation, balayez la membrane dans un système d’imagerie chimiluminescent pendant 1 à 3 secondes.