Mesure de l’activité hélicase d’une protéine cible à l’aide de duplex d’ARN marqués à la biotine

Les protéines ayant une activité d’ARN hélicase peuvent aider à dérouler et à séparer les molécules d’ARN individuelles dans un duplex d’ARN.

Pour déterminer l’activité hélicase d’une protéine, prenez des tubes contenant un mélange de duplex d’ARN marqués à la biotine avec un surplomb de 5', d’ATP et de pièges à ARN - des brins non marqués complémentaires aux brins biotinylés des duplex.

Ajoutez la protéine à activité hélicase dans chaque tube et incubez pendant des durées différentes. La protéine se lie au surplomb de 5 pieds des duplex.

À l’aide de molécules d’ATP, il brise les liaisons hydrogène entre deux brins duplex, ce qui entraîne leur déroulement et la libération de l’ARN simple brin biotinylé. Les pièges à ARN interagissent avec les brins marqués à la biotine, empêchant le recuit avec les brins séparés.

Terminez la réaction à l’aide d’un tampon de terminaison.

Chargez les échantillons dans différents puits d’un gel de polyacrylamide natif. Exécutez l’électrophorèse. L’ARN monocaténaire de faible poids moléculaire se déplace plus rapidement que les duplex de haut poids moléculaire. Ce déplacement de mobilité génère deux bandes distinctes.

Épongez le gel sur une membrane en