Dosage par extraction d’ARN-protéine pour isoler des protéines de liaison à l’ARN par extraction par affinité

Pour isoler les protéines de liaison à l’ARN, ou RBP - régulateurs post-transcriptionnels - prenez une suspension de petites sondes d’ARN contenant un élément riche en adénylate-uridylate, ou ARE - une séquence reconnue par les RBP cibles. Les sondes d’ARN sont marquées avec de la desthiobiotine – un dérivé de la biotine.

Ajoutez des billes magnétiques enrobées de streptavidine – une protéine ayant une affinité pour la biotine. Incuber sous agitation pour éviter que les billes ne se déposent. L’ARN marqué à la desthiobibiotine se lie à la streptavidine, immobilisant ainsi l’ARN sur les billes.

Sous le champ magnétique, les billes s’accumulent sur le côté du tube. Retirez le surnageant. Remettre les billes en suspension dans un tampon fournissant un pH optimal pour la liaison de l’ARN-RBP.

Lors de l’exposition à l’aimant, les billes s’accumulent sur le côté du tube. Jetez le surnageant. Remettre les billes en suspension dans une solution contenant les RBP cibles et incuber sous agitation.

Les RBP cibles possèdent des motifs de reconnaissance d’ARN qui reconnaissent la séquence ARE et se lient à l’ARN, formant ainsi un complexe ARN-protéine immobilisé sur les billes.

Sous le champ ma