Dosage par extraction d’ARN-protéine pour isoler des protéines de liaison à l’ARN par extraction par affinité

Pour isoler les protéines de liaison à l’ARN, ou RBP - régulateurs post-transcriptionnels - prenez une suspension de petites sondes d’ARN contenant un élément riche en adénylate-uridylate, ou ARE - une séquence reconnue par les RBP cibles. Les sondes d’ARN sont marquées avec de la desthiobiotine – un dérivé de la biotine.

Ajoutez des billes magnétiques enrobées de streptavidine – une protéine ayant une affinité pour la biotine. Incuber sous agitation pour éviter que les billes ne se déposent. L’ARN marqué à la desthiobibiotine se lie à la streptavidine, immobilisant ainsi l’ARN sur les billes.

Sous le champ magnétique, les billes s’accumulent sur le côté du tube. Retirez le surnageant. Remettre les billes en suspension dans un tampon fournissant un pH optimal pour la liaison de l’ARN-RBP.

Lors de l’exposition à l’aimant, les billes s’accumulent sur le côté du tube. Jetez le surnageant. Remettre les billes en suspension dans une solution contenant les RBP cibles et incuber sous agitation.

Les RBP cibles possèdent des motifs de reconnaissance d’ARN qui reconnaissent la séquence ARE et se lient à l’ARN, formant ainsi un complexe ARN-protéine immobilisé sur les billes.

Sous le champ magnétique, les billes se déplacent vers l’aimant sans perturber les interactions protéine-ARN. Jetez le surnageant. Remettre les billes en suspension dans un tampon d’élution contenant de la biotine.

La biotine déplace la desthiobiotine des billes en se liant de manière compétitive à la streptavidine, éluant ainsi le complexe protéine-ARN.

Évaluer la présence des RBP cibles dans l’éluat pour confirmer les interactions protéine-ARN.

Prélaver 50 microlitres de billes magnétiques de streptavidine pour 50 picomoles d’ARN. Vortex le tube avec des billes magnétiques de streptavidine pendant 15 secondes. Après avoir tourbillonné rapidement, retirez 200 microlitres dans un tube de verrouillage sûr propre de 1,5 millilitre à l’aide de pointes de pipette coupées. Ensuite, placez le tube sur un support magnétique de sorte que les billes s’accumulent sur le côté du tube et attendez une minute. Retirez le liquide de remise en suspension.

Pour laver les billes, retirez le tube du support magnétique à 400 microlitres de solution d’hydroxyde de sodium à 0,1 molaire, de chlorure de sodium à 0,05 molaire, et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois. Replacez le tube sur le support magnétique et attendez une minute, puis récupérez le surnageant.

Lavez les billes avec 200 microlitres de chlorure de sodium de 100 millimolaires et retirez le surnageant. Ajouter 200 microlitres de 20 millimolaires Tris. Remettez les billes en suspension par pipetage et placez le tube sur le support magnétique. Au bout d’une minute, retirez le surnageant. Ensuite, retirez le tube du support magnétique à 200 microlitres de tampon de capture d’ARN 1x et remettez en suspension les billes magnétiques de streptavidine en tourbillonnant brièvement.

Retirez 50 microlitres de billes magnétiques de streptavidine et ajoutez-les à chaque tube d’ARN marqué à l’aide d’une pointe de pipette coupée. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante sur un rouleau. Une fois que le tube est resté sur le support magnétique pendant une minute, retirez le surnageant. Ajoutez 50 microlitres de Tris de 20 millimolaires aux billes et remettez-les en suspension. Ensuite, placez les tubes dans le support magnétique. Au bout d’une minute, retirez le surnageant.

Ajoutez 100 microlitres de 1x tampon de liaison protéine-ARN aux billes et mettez-les en suspension. Ensuite, replacez les tubes dans le support magnétique. Une fois que les tubes sont restés dans le support pendant 1 minute, récupérez le surnageant. Ajouter 100 microlitres de mélange maître B. Remettre en suspension en pipetant doucement de haut en bas et éviter de créer des bulles. Incuber des tubes de réaction pendant 60 minutes à 4 degrés Celsius sur un rouleau.

Passez aux étapes de lavage et d’élution. Placez les tubes dans un support magnétique. Récupérez le flux et transférez-le dans un nouveau tube. Pipette 100 microlitres de 1X tampon de lavage sur les billes. Remettez doucement en suspension. Remettez-les dans le support. Attendez une minute et jetez le surnageant. Répétez l’étape deux fois.

Ajoutez 40 microlitres de tampon d’élution aux billes magnétiques. Mélanger en pipetant de haut en bas et incuber sur un agitateur à tube. Placez les tubes dans un support magnétique, attendez une minute et prélevez l’échantillon d’éluat. Placer sur de la glace et utiliser pour l’analyse en aval.