Thermophorèse à l’échelle microscopique pour étudier les interactions protéine-lipide en solution

Pour étudier l’interaction des protéines avec les molécules lipidiques, il faut commencer par deux tubes capillaires. Ajoutez des protéines de test marquées à un colorant fluorescent dans les deux tubes et des molécules lipidiques non marquées à l’un d’entre eux. Placez ces capillaires dans un réseau et placez-les à l’intérieur d’un instrument de thermophorèse à l’échelle microscopique.

Irradiez le capillaire contenant des protéines avec une lumière infrarouge focalisée, créant une élévation de température dans le point focal qui se diffuse à travers la solution, générant un gradient de température dans une région étroite contenant des protéines marquées par fluorescence.

Le détecteur de fluorescence collecte le signal de fluorescence à partir du même endroit du capillaire, là où le laser est focalisé. Le processeur convertit le signal et génère un tracé de la fluorescence relative en fonction du temps.

Dans un gradient de température, les protéines marquées commencent à migrer de la région la plus chaude vers la région plus froide, présentant une thermophorèse - un phénomène de migration dépendant de la température.

En raison de la thermophorèse, l’intensité de la fluorescence diminue progressivement au fil du temps et atteint un état stable, où les protéines marquées atteignent l’équilibre.

Irradier le capillaire contenant un mélange protéine-lipide, créant un gradient de température.

Au cours de la thermophorèse, les protéines marquées en migration interagissent avec les molécules lipidiques, formant des complexes lipides-protéines avec des masses moléculaires plus élevées. Cela entraîne un retard de leurs mouvements.

Cette migration différentielle provoque un décalage de la fluorescence, confirmant une interaction protéine-lipide réussie.

Avant de commencer une analyse, allumez l’interrupteur d’alimentation à l’arrière de l’appareil MST et ouvrez le logiciel de contrôle. Vérifiez que l’ordinateur est connecté à l’appareil et qu’il est à l’état « Connecté », et réglez le MST avant sur 3 secondes, le MST sur 30 secondes et la récupération de fluorescence sur 1 seconde après 1 seconde.

Pour chaque tube capillaire, entrez le nom du ligand cible, le nom de l’analyte du ligand, la concentration de la cible et la concentration de titrage la plus élevée à l’aide du rapport de titrage de remplissage automatique. Sélectionnez une plage de puissances MST et entrez les valeurs de chaque puissance pour tester l’ajustement de fixation le plus robuste.

Pour préparer des échantillons de MST marqués, diluez une solution de Vam7-octahistidine à une concentration de 200 nanomolaires et un colorant NTA-Atto 647 à une concentration de 100 nanomolaires, tous deux dans du PBS. Mélangez le colorant Vam7-octahistidine et le colorant NTA-Atto 647 dans un rapport volumétrique de 1 à 1, et laissez reposer le mélange à température ambiante, à l’abri de la lumière, pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, centrifugez le mélange de colorants et de protéines et conservez la solution à 4 degrés Celsius jusqu’à quelques heures avant de l’utiliser. Ensuite, préparez l’échantillon. Prenez le colorant sur le ligand et exposez l’analyte.

Pour la thermophorèse à l’échelle microscopique de l’échantillon, ouvrez l’appareil et faites glisser le rack capillaire vers l’extérieur. Chargez les capillaires d’échantillons dans le rack avec la concentration la plus élevée à la position 1 et sélectionnez le canal rouge dans le logiciel de contrôle. Ensuite, chargez le rack dans l’instrument. Ensuite, sélectionnez une plage de puissance MST et lancez la mesure Cap Scan + MST et évaluez la réponse de décalage.