JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 2:43 min • July 8th, 2025
Les interactions protéine-phospholipide sur la membrane cellulaire sont cruciales pour la régulation de plusieurs processus cellulaires.
Pour détecter les interactions protéine-phospholipide cibles in vitro à l’aide de la cytométrie en flux quantitative, prenez un tube contenant une concentration souhaitée de mimique de membrane cellulaire (vésicules phospholipidiques de la taille d’un micron et marquées à un colorant lipophile) dans un tampon.
Ajouter une concentration appropriée de différentes protéines cibles marquées par fluorescence dans la solution.
Injectez la suspension dans le cytomètre en flux. Réglez les paramètres du système fluidique sur un faible débit pour laisser suffisamment de temps pour les interactions protéine-phospholipide.
Au fur et à mesure que les protéines marquées par fluorescence et les vésicules phospholipidiques interagissent dans le canal d’écoulement, la concentration de protéines liées aux vésicules augmente.
Lorsque ces complexes traversent les faisceaux laser à partir de canaux de fluorescence spécifiques fournissant des longueurs d’onde appropriées, ils deviennent excités. Ces protéines excitées et les vésicules phospholipidiques du complexe émettent des signaux de fluorescence respectifs lors de la relaxation à l’état fondamental, qui sont capturés par les détecteurs appropriés.
La détection d’une intensité de fluorescence moyenne élevée des protéines est indicative d’une liaison des protéines aux vésicules phospholipidiques.
Commencer les expériences de liaison cinétique en diluant des vésicules phospholipidiques dans le tampon de Tyrode à une concentration de 1 micromolaire et un volume total de 250 microlitres. Ensuite, mélangez le facteur de coagulation X ou fX-fd marqué par fluorescence à une concentration de 500 nanomolaires avec les vésicules phospholipidiques dans un rapport de 1:1 pour obtenir un volume total de 500 microlitres.
Injecter immédiatement 500 microlitres de la suspension mixte dans le cytomètre en flux à un débit avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et un filtre d’émission de 585 nanomètres avec une largeur de 42 pour le canal FL2.
Ensuite, mesurez la fluorescence moyenne dans le canal FL4 avec une excitation à 633 nanomètres et un filtre d’émission à 660 nanomètres avec une largeur de 20. Lorsque la saturation de liaison est atteinte, diluez rapidement l’échantillon 20 fois avec le tampon de Tyrode et surveillez la dissociation jusqu’à ce qu’une fluorescence de base ou un plateau soit atteint.