Technique de microgravimétrie dissipative pour étudier l’interaction protéine-lipide bicouche

Pour étudier l’interaction entre une protéine de liaison aux phospholipides et une bicouche lipidique par microgravimétrie dissipative, prenez une microbalance avec un capteur à quartz. Lors de l’application d’une tension appropriée, la couche de quartz - prise en sandwich entre deux électrodes métalliques - oscille à une fréquence spécifique.

Ajoutez une suspension de petites vésicules unilamellaires - constituées d’une seule bicouche lipidique - sur le capteur. Les vésicules s’adsorbent sur la surface hydrophile recouverte de silice, ce qui augmente la masse du capteur et diminue proportionnellement sa fréquence d’oscillation.

Les vésicules remplies de tampon agissent comme une couche viscoélastique, conduisant à la dissipation - l’amortissement de l’oscillation. Les vésicules adsorbées se rompent, libérant le tampon qu’il contient. La diminution de masse qui en résulte augmente la fréquence d’oscillation.

Les vésicules rompues forment une bicouche continue, imitant une membrane biologique. La rigidité de la bicouche diminue la dissipation.

Ajoutez un tampon contenant des ions calcium, ainsi que la protéine cible. Les ions calcium se lient à la protéine et modifient sa conformation, ce qui permet de se lier aux molécules lipidiques de la bicouche.

La liaison aux protéines augmente la masse du capteur, ce qui entraîne une diminution de la fréquence. L’intégrité structurelle de la bicouche n’est pas affectée, ce qui n’entraîne qu’une légère augmentation de la dissipation.

Ajoutez un agent chélateur pour chélater les ions calcium - dissociant les protéines de la bicouche.

L’absence de protéines liées ramène la fréquence et la dissipation de l’oscillation aux niveaux non liés aux protéines, confirmant que la liaison est uniquement dépendante du calcium et que la bicouche reste intacte.

Fixez soigneusement les capteurs nettoyés au plasma dans les quatre chambres d’écoulement à l’aide d’une pince à épiler. Évitez toute pression ou torsion des chambres et des tubes qui pourrait provoquer des fuites. Rincez le système avec un tampon de citrate en mode d’écoulement ouvert pendant 10 minutes.

Lancez le programme. Commencez à enregistrer tout changement de fréquence et de dissipation de la première tonalité fondamentale et des harmoniques à l’aide du logiciel jusqu’à ce que les lignes de base de fréquence et de dissipation soient stables.

Lorsque les lignes de base sont stables, appliquez la suspension SUV dans le tampon de citrate. À l’aide d’un récipient de réaction, retirez 1,5 millilitre de volume mort. Ensuite, fermez le système en mode de flux en boucle. Enregistrez le décalage de dissipation de fréquence pendant 10 minutes supplémentaires.

Lorsque le SLB est stable, équilibrez le système avec le tampon en marche aux concentrations de calcium requises en mode d’écoulement libre pendant 40 minutes. Ajoutez les protéines contenant du calcium dans le tampon courant. Effectuez l’application de la protéine en mode boucle jusqu’à ce qu’un état d’équilibre stable soit atteint.