Imagerie d’une seule molécule pour visualiser l’assemblage de condensats de protéines de fusion sur des rideaux d’ADN

JoVE Encyclopedia of Experiments

Techniques biologiques

0 vues • 4:06 min • July 8th, 2025

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Une protéine de fusion oncogénique chimérique contient le domaine N-terminal de faible complexité, LCD, d’une protéine de liaison à l’ARN fusionnée avec le domaine de liaison à l’ADN, DBD, d’une protéine de facteur de transcription. Ces protéines forment un condensat de protéines, qui recrute l’ARN polymérase-II et stimule l’oncogenèse.

Pour visualiser l’assemblage des condensats de protéines par imagerie à molécule unique, commencez par une cellule de flux d’ADN, une lame de verre de silice fondue équipée d’orifices d’injection à l’entrée et à la sortie. La surface de la cellule d’écoulement est recouverte d’une bicouche lipidique biotinylée pour protéger la surface et fabriquée avec une barrière en zigzag.

Connectez-le à un système microfluidique. Introduisez une solution de streptavidine, qui se lie à son ligand à haute affinité de liaison, la biotine, sur la couche lipidique. Injectez de l’ADN lambda double brin marqué à la biotine, qui contient plusieurs répétitions de séquences de liaison aux protéines de fusion. La streptavidine de la bicouche lipidique se lie à la biotine de l’ADN et attache l’ADN lambda à la bicouche.

Rincez avec un tampon approprié. La force hydrodynamique de son écoulement redresse les molécules d’ADN ancrées, leur permettant de pendre comme des rideaux d’ADN sur les barrières.

Placez la cellule sous un microscope à fluorescence. Injectez une solution de fluorophores verts liant l’ADN. Ensuite, injectez une solution de protéine de fusion marquée sur un fluorophore magenta de liaison aux protéines via son domaine LCD, et incubez.

Les protéines de fusion marquées se lient à la séquence cible de l’ADN lambda pour former des condensats sur toute la longueur de l’ADN. Lors de l’excitation, les fluorophores liés à l’ADN et aux protéines deviennent fluorescents.

Les condensats de la protéine de fusion apparaissent sous forme de puncta de couleur magenta sur l’ADN double brin marqué par fluorescence verte.

Pour imager la formation de condensation d’EWS-FLI1 sur les rideaux d’ADN, ouvrez le logiciel d’imagerie et trouvez et marquez les positions des neuf motifs en zigzag en fond clair. Ensuite, allumez le débit à 0,2 millilitre par minute pour colorer l’ADN avec un colorant ADN double brin pendant 10 minutes.

Ensuite, diluez la protéine mCherry-EWS-FLI1 avec le tampon d’imagerie à une concentration de 100 nanomoles et 100 microlitres. Ensuite, chargez l’échantillon de protéines à travers la valve avec une seringue en verre de 100 microlitres et modifiez le débit à 0,4 millilitre par minute.

Après avoir allumé le laser de 488 nanomètres, pré-scannez chaque région pour vérifier l’état de distribution de l’ADN et sélectionnez la région dans laquelle les molécules d’ADN se répartissent uniformément. Ensuite, réglez la puissance laser à 10 % pour le laser de 488 nanomètres et à 20 % pour le laser de 561 nanomètres, et à l’aide du wattmètre, mesurez la puissance réelle du laser près du prisme.

Commencez à acquérir des images à deux secondes d’intervalle avec des lasers de 488 et 561 nanomètres simultanément. Ensuite, passez de la vanne du mode manuel au mode injection pour permettre au tampon d’imagerie de rincer l’échantillon de protéines dans la cellule d’écoulement après 60 secondes.

Pour retirer l’EWS-FLI1 libre, continuez à laver la cellule d’écoulement avec le tampon d’imagerie pendant cinq minutes avec uniquement le laser de 561 nanomètres allumé. Ensuite, arrêtez l’écoulement et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après 10 minutes, allumez le flux à 0,4 millilitre par minute pour laisser l’ADN s’étendre, et acquérez des images à intervalles de deux secondes entre différentes images pour obtenir des données à haut débit sur la formation de condensats EWS-FLI1.

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Dernière mise à jour : 22 août 2026