Dosage de la modulation du pH sur les bicouches lipidiques supportées pour détecter les interactions protéine-phosphoinositide

Le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, ou PIP2, est un phospholipide phosphorylé mineur lié à la membrane. La phospholipase C, ou PLC, avec des domaines spécifiques de liaison à PIP2, se lie à PIP2, générant des messagers secondaires essentiels à plusieurs processus cellulaires.

Pour détecter les interactions PLC-PIP2 in vitro, commencez par une petite vésicule unilamellaire, SUV, en suspension acide, comprenant un mélange de PIP2 et de phospholipides, dont l’un est conjugué à un colorant fluorescent sensible au pH.

Pipetez la solution dans le tube d’entrée et de sortie d’un dispositif microfluidique pré-assemblé. Transférez et fixez l’appareil sur une platine de microscope à fluorescence. Par gravité, les SUV traversent le plancher à microcanaux, constitué d’une lamelle en verre hydrophile.

Les SUV s’adsorbent sur la surface du verre, le pH de la solution réduisant la répulsion électrostatique entre les deux. Les SUV interagissent avec la surface, se déforment et fusionnent pour former de grandes vésicules.

Après une couverture de surface critique, les vésicules se rompent spontanément, formant une bicouche lipidique soutenue, SLB. Passez un tampon à travers le canal, en éliminant les vésicules non adsorbées.

À l’aide d’un canal de fluorescence approprié, imagez le microcanal pour visualiser et mesurer la fluorescence du colorant sensible au pH (hautement fluorescente à faible pH) dans le SLB.

Introduire une solution d’API recombinante dans le microcanal. Le pH neutre de la solution, inférieur au point isoélectrique de l’API, rend l’API chargé positivement.

L’API recombinant, avec son domaine de liaison à PIP2, se lie au PIP2, recrutant des ions hydroxyde chargés négativement à la surface de la bicouche. Cela rend la surface bicouche plus basique, déplaçant l’état de protonation du colorant et provoquant une extinction de fluorescence, indiquant des interactions PLC-PIP2.

Transférez 100 microlitres de phosphatidyl inositol-4 5-bisphosphate contenant de petites vésicules unilamellaires dans un tube de microcentrifugation de 0,65 millilitre. Ajustez le pH de la solution à environ 3,2 en ajoutant 6,4 microlitres d’acide chlorhydrique normal 0,2.

Pipetez 10 microlitres de la solution de petite vésicule unilamellaire au pH ajusté dans chaque canal par l’entrée et appliquez une pression à travers la pipette jusqu’à ce que la solution atteigne la sortie. Détachez l’embout de la pipette et laissez-le attaché à l’appareil. Après avoir répété cette étape pour chaque canal, incubez l’appareil pendant 10 minutes à température ambiante.

L’injection des vésicules dans les microcanaux doit être effectuée immédiatement après l’assemblage du dispositif. Pendant ce temps, coupez des ensembles de tubes d’entrée et de sortie. À l’aide d’une pince à épiler, connectez le jeu de tubes de sortie à l’appareil, puis collez l’appareil sur une platine de microscope.

Immergez une extrémité du tube d’entrée dans 25 millilitres de tampon de coulée contenu dans un tube conique et collez-le pour vous assurer que le tube est bien fixé. À l’aide d’un cric de laboratoire, placez le tube conique sur un sol plus élevé que l’appareil afin de pousser la solution à travers les microcanaux par gravité.

Pour chaque tube d’entrée, utilisez une seringue pour prélever 1 millilitre de tampon de coulée à l’extrémité libre du tube. Retirez la pointe de la pipette de l’entrée et insérez l’extrémité libre du tube d’entrée dans l’appareil. Répétez ce processus pour connecter tous les morceaux de tube d’entrée à l’appareil. L’écoulement du tampon à travers les canaux permet d’éliminer les vésicules non rompues en excès et d’équilibrer la bicouche dans les conditions expérimentales.

Ensuite, ouvrez le logiciel de contrôle du microscope. Sur le panneau de gauche, cliquez sur l’onglet « Microscope » et choisissez l’objectif « 10x ». Cliquez sur « Live », puis sur les icônes d’image « Alexa 568 » dans la barre d’outils. À l’aide des boutons de réglage Fine et Coarse, concentrez-vous sur les microcanaux. Parcourez l’appareil pour vérifier la qualité des SLB et des canaux.

Ensuite, cliquez sur l’icône d’image « FL Shutter Closed » dans la barre d’outils. Cliquez sur l’onglet « Acquisition » et, sous « Réglages de base », sélectionnez le temps d’exposition. Réglez le temps d’exposition sur 200 millisecondes. Dans le panneau de gauche, cliquez sur « Acquisition multidimensionnelle ». Dans le menu « Filtres », sélectionnez le canal rouge. Ensuite, cliquez sur le menu « Time-lapse ». Réglez l’intervalle de temps sur 5 minutes, la durée sur 30 minutes et le menu de dépassement.

Sélectionnez l’outil « Cercle » sous l’onglet « Mesurer » et dessinez un cercle dans n’importe quel canal. Faites un clic droit pendant que le cercle est sélectionné et choisissez « Propriétés ». Sous l’onglet « Profil », cochez « tous les T » pour visualiser l’intensité de fluorescence en fonction du temps. Assurez-vous que cette courbe atteint un plateau, qui indique l’équilibre, avant de passer à l’étape suivante.

Abaissez la solution tampon à un niveau égal à celui de l’appareil pour arrêter l’écoulement. Un à la fois, détachez chaque tube de sortie et appliquez 200 microlitres de chaque dilution de protéine dans le canal de sortie à l’aide d’une pipette. N’appliquez aucune pression. Laissez la gravité faire le travail. Détachez l’embout de la pipette et laissez-le fixé au dispositif microfluidique. Répétez ce processus pour chaque canal et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans les canaux pendant ce processus.

Ensuite, abaissez le tube d’entrée jusqu’à un sol sous le dispositif microfluidique pour commencer à faire circuler la protéine à travers les microcanaux. Collez l’extrémité libre du tube sur un conteneur à déchets. Faites couler les dilutions du domaine d’homologie de Pleckstrin pendant 30 minutes. Sur le panneau gauche du logiciel, sous l’onglet « Time-Lapse », cliquez sur « Démarrer » pour recommencer l’imagerie.