Chromatographie d’exclusion stérique avec diffusion de la lumière multi-angle pour les oligomères de protéines

Un oligomère protéique est un complexe de plusieurs sous-unités protéiques qui sont liées entre elles pour former une unité fonctionnelle plus grande.

Pour déterminer la masse moléculaire des monomères protéiques et de leurs oligomères en solution par SEC-MALS, une combinaison de chromatographie d’exclusion stérique et de diffusion de la lumière multi-angle, commence par une colonne de chromatographie d’exclusion stérique, ou SEC.

La colonne contient des billes de gel sphériques poreuses en forme de passoire qui piègent des molécules de plus petite taille à l’intérieur. Équilibrez la colonne avec un tampon compatible avec l’état natif de la protéine.

Chargez un échantillon contenant des monomères et des oligomères de protéines en haut de la colonne.

Pendant l’écoulement, les oligomères traversent l’espace interparticulaire de la colonne, tandis que les monomères sont piégés dans les pores des billes. Cela fait que les oligomères protéiques de plus grande taille se déplacent plus rapidement que les monomères de plus petite taille.

Dirigez les oligomères à élution rapide, suivis des monomères à élution lente, vers le détecteur MALS.

Lorsqu’ils traversent le détecteur, une lumière laser les éclaire, qui est diffusée sous différents angles. Les oligomères multi-sous-unitaires diffusent plus de lumière que le monomère.

L’intensité de la lumière diffusée sous plusieurs angles est directement proportionnelle au poids moléculaire de l’oligomère et du monomère de la protéine.

Commencer cette procédure par la préparation du système SEC-MALS comme décrit dans le protocole texte. À l’aide de réactifs de qualité HPLC, préparez un litre de solution saline tamponnée au phosphate avec 50 à 100 millilitres de chlorure de sodium. Filtrez le tampon à 0,1 micron à l’aide d’un filtre en polyéther sulfone ou similaire.

Filtrez les premiers 50 à 100 millilitres de tampon sur une bouteille à déchets afin d’éliminer les particules des filtres secs. Ensuite, filtrez le reste dans une bouteille propre et stérile qui a été préalablement lavée avec de l’eau filtrée et déminéralisée et conservée pour empêcher la poussière de pénétrer.

Rincez la colonne pendant la nuit à un débit de 0,5 millilitre par minute pour équilibrer la colonne dans le tampon et éliminer les particules. Utilisez le mode « Flux continu » du FPLC et assurez-vous que le flux ne s’arrête pas tant que toutes les exécutions SEC-MALS ne sont pas terminées. Placez la cellule d’écoulement dRI en mode purge pendant le rinçage de nuit.

Au début du rinçage, augmentez progressivement le débit pour éviter l’effet de « perte de colonne » causé par un changement soudain de pression dans la colonne. Désactivez la purge avant de commencer les exécutions d’échantillons.

Vérifiez la propreté du système en tapotant légèrement le tube en aval de la colonne pour libérer les particules accumulées. Observez le signal dans le détecteur à 90 degrés sur l’écran du panneau avant de l’instrument MALS. Vérifiez que le bruit de crête à crête n’est pas supérieur à 50 à 100 microvolts. Vérifiez également que l’indice de réfraction ou le signal IR est stable à moins de 1 x ^10-7 unités d’indice de réfraction.

Effectuez une injection à blanc pour vérifier que l’injecteur est exempt de particules. Un « blanc » est simplement le tampon de coulée préparé dans un flacon stérile frais. Si le pic de particules n’est pas de plus de 1 millilitre de volume et pas plus de 5 millivolts au-dessus de la ligne de base, le système est prêt pour les échantillons. Sinon, effectuez des injections supplémentaires à blanc jusqu’à ce qu’il soit propre ou effectuez un entretien pour nettoyer l’injecteur.

Maintenant, préparez au moins 200 microlitres de BSA à 1 à 2 milligrammes par millilitre dans le tampon SEC. Filtrez la protéine à 0,025 micron à l’aide d’un filtre à pointe de seringue. Jetez les premières gouttes de filtrat afin d’éliminer les particules des filtres secs. Vous pouvez également centrifuger l’échantillon à 10 000 fois g pendant 15 minutes pour permettre la précipitation d’agrégats non solubles et d’autres grosses particules. Ensuite, injectez 100 microlitres de la solution BSA dans la boucle.