Test de rapporteur basé sur ELISA pour étudier l’interaction récepteur-ligand dans les cellules BW

Pour étudier les interactions récepteur-ligand, commencez avec une plaque multipuits contenant des milieux avec des cellules cibles exprimant des ligands de test à leur surface.

Ajoutez des cellules BW de souris modifiées - une nouvelle population de cellules B exprimant des récepteurs chimériques liés à la membrane. Les récepteurs chimériques comprennent le domaine extracellulaire d’un récepteur spécifique fusionné au domaine de signalisation transmembranaire et intracellulaire du récepteur des cellules B.

Les ligands des cellules cibles interagissent avec le domaine extracellulaire des récepteurs chimériques des cellules BW, provoquant l’activation du domaine de signalisation intracellulaire dans les cellules BW. Cela déclenche la signalisation en aval et la production de cytokines – des molécules rapporteures sécrétoires qui sont libérées à l’extérieur des cellules BW, apparaissant dans les médias.

Centrifugez la plaque. Transférez le surnageant contenant des cytokines dans une plaque ELISA pré-enduite d’anticorps anti-cytokines. Les cytokines interagissent avec les régions Fab des anticorps, conduisant à leur immobilisation à la surface de la plaque.

Traitez la plaque avec une solution de blocage pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Ajoutez des anticorps anti-cytokines biotinylés, qui interagissent avec les cytokines pré-liées et forment des complexes immunitaires.

Recouvrir la plaque d’une solution de streptavidine conjuguée à des enzymes. La streptavidine se lie à la biotine sur les complexes immunitaires.

Traitez la plaque avec un substrat. L’interaction enzyme-substrat produit un produit coloré, conférant la même couleur à la solution. La solution colorée confirme la présence de molécules rapporteures, indiquant une interaction récepteur-ligand réussie.

Utilisez 50 000 cellules BW transfectées avec leurs cibles souhaitées dans un seul puits d’une plaque de 96 puits. Incuber la plaque pendant 48 heures. Ensuite, congelez la plaque à -20 degrés Celsius.

Enduisez une plaque ELISA d’un anticorps anti-IL-2 de souris. Placez 0,05 % microgrammes d’anti-souris-IL-2 dans un volume de 50 microlitres de PBS dans chaque puits. Incuber la plaque enduite pendant la nuit à 4 degrés Celsius.

Utilisez une brève période d’incubation à 37 degrés Celsius pour décongeler les cellules d’EBW congelées qui ont été précédemment incubées avec leurs cibles. Ensuite, centrifugez la plaque et transférez 100 microlitres de surnageant de chaque puits vers la plaque ELISA pré-enduite, et incubez à 37 degrés Celsius pendant 2 heures.

Après cela, ajoutez de la biotine anti-souris-IL-2 à la plaque ELISA. Ensuite, après l’incubation et le lavage, ajoutez de la streptavidine conjuguée à la HRP dans la plaque. Après l’incubation et le lavage, ajoutez 100 microlitres de la solution de substrat TMB dans chaque puits de la plaque ELISA. Enfin, lisez la plaque ELISA à 650 nanomètres.