Sonde de force biomembranaire pour quantifier les interactions récepteur-ligand

L’interaction entre un récepteur de lymphocytes T, TCR, et un peptide antigénique présenté par le CMH, ou complexe majeur d’histocompatibilité, sur une cellule présentatrice d’antigène, APC, fait que les lymphocytes T exercent une force mécanique sur l’APC. Ce phénomène est nécessaire à l’activation des lymphocytes T.

Pour quantifier les interactions récepteur-ligand à l’aide d’une sonde de force biomembranaire, BFP, commencez par une chambre cellulaire personnalisée basée sur des lames. Placez la chambre cellulaire sous un microscope.

Injectez dans la chambre des suspensions de globules rouges gonflés biotinylés, des billes de verre sondées recouvertes de complexes CMH-streptavidine-biotine liés aux peptides et des lymphocytes T. Positionnez la sonde, la cible et les micropipettes auxiliaires remplies de tampon autour de la chambre.

Aspirez un globule rouge biotinylé à l’aide de la pipette à sonde, en le positionnant dans une zone blanche. Aspirez une cellule T avec la micropipette cible, en la positionnant sur la droite du globule rouge. Aspirez une perle de sonde à l’aide de la micropipette auxiliaire et fixez-la à l’apex du RBC. La streptavidine de la perle se lie à la biotine du RBC et forme une sonde de force.

Alignez la cellule T avec la sonde de force pour permettre au TCR d’interagir avec son ligand – le peptide lié au CMH – et à la cellule T d’exercer une force sur le GR. Rétractez la cellule T pour rompre la liaison TCR-peptide, qui déforme le globule rouge et déplace la bille.

Mesurez la force nécessaire pour rompre la liaison : une liaison plus forte a besoin d’une force plus élevée et de plus de temps pour se rompre, ce qui indique une durée de vie plus longue.

Pour commencer l’expérience BFP, allumez le microscope et la source lumineuse. Placez la chambre sur la platine principale du microscope. L’étape suivante consiste à installer les trois micropipettes du BFP. La sonde à gauche sert à saisir un RBC. L’objectif à droite est d’attraper la cellule, et l’assistant en bas à droite sert à saisir une perle.

Pour l’installation, utilisez un micro-injecteur pour remplir une micropipette avec un tampon expérimental. Retirez la micropipette du porte-pipette et maintenez-la à un endroit plus bas pour permettre au liquide de s’écouler de la pointe. Insérez rapidement la micropipette dans l’embout du support, en vous assurant qu’aucune microbulle d’air ne pénètre dans la micropipette pendant l’insertion.

Serrez la vis du support, puis montez chaque support de pipette sur le micromanipulateur correspondant. Poussez la micropipette vers la chambre de manière à ce que ses pointes pénètrent dans la zone tampon de la chambre. Ajustez la position de la micropipette et trouvez-la dans le champ de vision du microscope.

Déplacez-vous dans l’étage du porte-chambre pour trouver les colonies des trois éléments une par une. Ajustez la position de la micropipette correspondante en tournant les boutons des manipulateurs pour laisser la pointe de la micropipette s’approcher d’une cellule ou d’une bille. Aspirez la cellule ou la bille en ajustant la pression à l’intérieur de la micropipette correspondante. Les trois micropipettes captureront les éléments correspondants.

Déplacez-vous autour de l’étage du support de chambre pour trouver un espace ouvert loin des colonies des éléments injectés où l’expérience sera réalisée.

Basculez le mode visuel du microscope pour visualiser l’image sur le programme informatique. Déplacez les trois éléments sur les pointes de la pipette dans le champ de vision du programme. Ensuite, alignez le cordon de la sonde et le RBC et manœuvrez soigneusement le cordon de la sonde jusqu’au sommet du RBC. Maintenant, appuyez brièvement sur la bille sur le RBC et rétractez-la doucement.

Ajustez la pression de la micropipette auxiliaire pour souffler doucement la perle afin qu’elle reste collée sur l’apex du RB. Éloignez la micropipette auxiliaire et alignez la cible et la perle de la sonde.

Dans le programme, dans la fenêtre Champ de vision, utilisez les outils du programme pour mesurer les rayons respectifs de la micropipette de la sonde, du RBC et de la surface de contact circulaire entre le RBC et la perle de la sonde. Ces valeurs permettent d’estimer la constante de ressort du RBC par l’équation énumérée dans le protocole de texte.

Après avoir entré la constante de ressort RBC souhaitée dans le programme, tracez une ligne horizontale à travers l’apex de la RBC qui donnera une courbe dans la fenêtre adjacente indiquant la luminosité de chaque pixel le long de cette ligne. Faites glisser la ligne de seuil pour qu’elle soit à environ la moitié de la profondeur de la courbe.

Ensuite, sélectionnez le mode d’expérience souhaité. Réglez les paramètres comme vous le souhaitez. Cliquez sur Démarrer, ce qui permet au programme de déplacer la pipette cible et d’entraîner la cible dans et hors du contact avec la sonde.

La collecte de données sera effectuée en parallèle, ce qui permettra d’enregistrer la position du cordon de sonde en temps réel. Arrêtez le programme en cliquant sur le bouton Arrêter l’expérience, auquel cas une fenêtre apparaîtra pour permettre d’enregistrer les données acquises.